[發明專利]一種量子點熒光編碼微球—滾環擴增高通量篩選G-四鏈體DNA的方法

有效

• 申請號: 201711461031.7
• 申請日: 2017-12-28
• 公開（公告）號: CN108085369B
• 公開（公告）日: 2021-07-09
• 發明（設計）人: 孫清江;屈曉君;卞非卡;劉玉乾
• 申請（專利權）人: 東南大學
• 主分類號: C12Q1/682
• 分類號: C12Q1/682
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 孫斌

本發明公開了一種量子點熒光編碼微球—滾環擴增篩選G?四鏈體DNA的方法，包括如下步驟：制備標記探針的量子點熒光編碼微球；靶標G?四鏈體DNA序列在量子點熒光編碼微球表面進行滾環擴增反應；通過G?四鏈體特異性識別分子對擴增產物進行染色；使用流式細胞儀對G?四鏈體DNA進行篩選。本發明中的量子點熒光編碼微球—滾環擴增篩選G?四鏈體DNA的方法，首次將滾環擴增和量子點熒光編碼微球相結合，實現G?四鏈體DNA高靈敏、特異檢測，并且準確度高，檢測范圍寬，為G?四鏈體DNA快速、高通量篩選提供了新方法。

技術領域

本發明屬于生物醫學領域，具體涉及一種量子點熒光編碼微球—滾環擴增方法高通量篩選G-四鏈體DNA。

背景技術

惡性腫瘤是危害人類生命健康的重大疾病。近年來以生物靶分子為基礎進行抗腫瘤藥物的篩選成為新的研究方向。人類基因組中含有大量可形成G-四鏈體的序列(約376000)，廣泛存在于染色體端粒區域(telo)、基因啟動子區域(如k-ras、bcl-2)、免疫蛋白開關區域、外顯子區域以及RNA當中。G-四鏈體與腫瘤的發生發展密切相關，穩定的G-四鏈體能夠抑制癌細胞中端粒酶的活性，或者作為沉默子元件關閉某些基因的轉錄。不同序列形成的G-四鏈體結構在鏈的螺旋取向、極性、空間結構特性等方面存在差異，導致與藥物分子作用強弱的不同。因此以G-四鏈體為作用靶點進行抗癌藥物篩選成為研究的熱點。

目前已有多種方法用于檢測G-四鏈體，包括分子印跡法、直接測序法、實時定量PCR、平面微陣列、蛋白探針和小分子探針等。但這些方法缺乏高通量檢測能力。

基于熒光編碼微球的高通量檢測整合了流式細胞技術與熒光微球技術的優勢，將熒光編碼微球技術、激光技術、應用流體學、高速數字信號技術和計算機運算法則相結合，具有高通量、高速度、重復性好、操作簡便等優點。然而大多數情況下檢測的靈敏度還無法滿足臨床分析的要求。

基于酶擴增的信號放大方法為提高檢測靈敏度提供了新的途徑。滾環擴增是一種恒溫核酸擴增方法。靶標DNA與鎖式探針的兩末端互補配對，利用連接酶連接環化形成環狀DNA，并將其作為模板，靶標DNA作為引物，在酶催化下合成包含成百上千個重復的模板互補片段的單鏈DNA。基于滾環擴增的信號放大具有靈敏度高、特異性好等特點，常應用于單核苷酸多態性、動植物病毒等檢測。

發明內容

發明目的：針對目前存在的問題，本發明提供一種量子點熒光編碼微球—滾環擴增篩選G-四鏈體DNA的方法，該方法可以靈敏、特異、快速、高通量篩選G-四鏈體DNA。

技術方案：為了實現上述目的，如本發明所述一種量子點熒光編碼微球—滾環擴增篩選G-四鏈體DNA的方法，包括如下步驟：

(1)制備標記探針的量子點熒光編碼微球；

(2)靶標G-四鏈體DNA序列在量子點熒光編碼微球表面進行滾環擴增反應；

(3)通過G-四鏈體特異性識別分子對步驟(2)量子點熒光編碼微球表面滾環擴增產物進行染色；

(4)使用流式細胞儀對G-四鏈體DNA進行篩選。

其中，所述標記探針包括三種捕獲探針和三種鎖式探針。

所述捕獲探針包括用于k-ras基因中G-四鏈體序列篩選的第一捕獲探針capture1，用于bcl-2基因中G-四鏈體序列篩選的第二捕獲探針capture 2，用于染色體端粒區域末端telo G-四鏈體序列篩選的第三捕獲探針capture 3，三種捕獲探針的5'端氨基化修飾。

所述鎖式探針包括與capture 1雜交的第一鎖式探針padlock 1；與capture 2雜交的第二鎖式探針padlock 2；與capture 3雜交的第三鎖式探針padlock 3；三種鎖式探針的5’端磷酸化修飾。