[發(fā)明專利]一種高效的外泌體分離方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711460799.2
• 申請(qǐng)日: 2017-12-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108085338A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-05-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳意雄
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海恒圓生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N15/62;C12N5/10
• 代理公司: 常州市權(quán)航專利代理有限公司 32280
• 代理人: 劉娟

本發(fā)明提供一種高效的外泌體分離方法，所述分離方法至少包括以下步驟：（1）向目標(biāo)細(xì)胞中導(dǎo)入帶有標(biāo)簽的CD63，培養(yǎng)；（2）離心后取上清液；（3）向上清液中加入磁性體，所述磁性體上含有能夠與CD63上的標(biāo)簽特異性結(jié)合的標(biāo)記物，孵育；（4）將上清液置于磁場(chǎng)中；（5）去除上清液后加入緩沖液，加入分選柱，利用緩沖液洗脫分選柱上滯留的外泌體，并收集。采用本發(fā)明所述的收集方法，收集效率高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種高效的外泌體分離方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

外泌體(exosome)是由細(xì)胞內(nèi)多泡體(multivesicular body，MVB)與細(xì)胞膜融合后，釋放到細(xì)胞外基質(zhì)中的一種直徑約30～120nm的膜性囊泡。最早由Johnstone等研究者在研究網(wǎng)織紅細(xì)胞向成熟紅細(xì)胞轉(zhuǎn)變過(guò)程時(shí)發(fā)現(xiàn)。又經(jīng)過(guò)多年研究，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)除了網(wǎng)織紅細(xì)胞以外，T細(xì)胞、B細(xì)胞、血小板、樹(shù)突細(xì)胞、肥大細(xì)胞等血細(xì)胞及上皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等其他非血源性細(xì)胞都會(huì)分泌外泌體，被分泌出的外泌體會(huì)進(jìn)入血液、唾液、尿液、及乳汁等體液中，通過(guò)循環(huán)系統(tǒng)到達(dá)其他細(xì)胞與組織，產(chǎn)生遠(yuǎn)程調(diào)控作用。

外泌體中包含多種RNA分子，包括mRNA、miRNA等。但也有少數(shù)報(bào)道指出，某些特殊來(lái)源的外泌體也會(huì)包含DNA分子，例如，有研究者發(fā)現(xiàn)惡性膠質(zhì)瘤及星形細(xì)胞瘤細(xì)胞所釋放的外泌體中可能含有線粒體DNA。自2007年首次在外泌體中發(fā)現(xiàn)mRNA和miRNA，研究者已在人類及小鼠外泌體中發(fā)現(xiàn)了數(shù)千個(gè)不同mRNA，而且有些轉(zhuǎn)錄本只存在于外泌體中，在胞內(nèi)卻無(wú)法檢測(cè)到。這表明，RNA進(jìn)入外泌體的過(guò)程會(huì)受到某些特殊的分選機(jī)制控制。目前，外泌體RNA分子收錄最全的數(shù)據(jù)庫(kù)共收錄2375個(gè)外泌體mRNA和764個(gè)miRNA，但是這也僅僅是能夠檢測(cè)到的所有外泌體RNA的一部分，仍舊有大量外泌體RNA的功能未知。

最常見(jiàn)的外泌體蛋白組成包括膜轉(zhuǎn)運(yùn)和融合相關(guān)蛋白(Rab GTPases、Annexins、Flotillin等)、多囊泡胞內(nèi)體產(chǎn)生相關(guān)蛋白(Alix、TSG101等)、熱休克蛋白家族(HSP70，HSP90)、整合素和四跨膜蛋白超家族(CD63、CD9、CD81、CD82等)，這些成分反映了其生物起源。蛋白質(zhì)，如CD9、CD63、CD81、TSG101、Alix和HSP70常見(jiàn)于大多數(shù)外泌體中。

目前，針對(duì)外泌體相關(guān)的功能學(xué)研究越來(lái)越多，但是從細(xì)胞中分離得到的外泌體時(shí)，回收率很低，需要收集大量細(xì)胞培養(yǎng)上清，以滿足實(shí)驗(yàn)需求。另外，目前公認(rèn)超離法是最常用的外泌體純化手段，采用低速離心、高速離心交替進(jìn)行，可分離到大小相近的囊泡顆粒。但過(guò)程比較費(fèi)時(shí)，且重復(fù)離心操作還有可能對(duì)囊泡造成損害，從而降低其質(zhì)量。此外，在研究特定細(xì)胞分泌的外泌體對(duì)其他細(xì)胞的功能研究時(shí)，通常在感染一段時(shí)間后，采用Western blot來(lái)驗(yàn)證，不能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種外泌體分離方法，用于解決現(xiàn)有技術(shù)的不足。

為實(shí)現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明提供一種高效的外泌體分離方法，所述分離方法至少包括以下步驟：

(1)向目標(biāo)細(xì)胞中導(dǎo)入帶有標(biāo)簽的CD63，使用細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；

所述標(biāo)簽是指可以起到標(biāo)記蛋白質(zhì)的物質(zhì)，可以采用現(xiàn)有技術(shù)中的作為標(biāo)簽的物質(zhì)以及方法。

優(yōu)選地，所述標(biāo)簽選自Flag、His6、GST、MBP、His-MBP、HA中的任意一種或幾種。

優(yōu)選地，所述CD63通過(guò)載體攜帶導(dǎo)入目標(biāo)細(xì)胞；所述載體是指pcDNA3.1。

優(yōu)選地，向目標(biāo)細(xì)胞中導(dǎo)入帶有標(biāo)簽的CD63后培養(yǎng)12～36h后篩選出含有CD63的陽(yáng)性克隆細(xì)胞，再繼續(xù)培養(yǎng)陽(yáng)性克隆細(xì)胞。所述篩選的方法可以是使用G418抗生素篩選細(xì)胞。