[發明專利]一種高效的外泌體分離方法在審
| 申請號： | 201711460799.2 | 申請日： | 2017-12-28 |
| 公開（公告）號： | CN108085338A | 公開（公告）日： | 2018-05-29 |
| 發明（設計）人： | 陳意雄 | 申請（專利權）人： | 上海恒圓生物科技有限公司 |
| 主分類號： | C12N15/85 | 分類號： | C12N15/85;C12N15/62;C12N5/10 |
| 代理公司： | 常州市權航專利代理有限公司 32280 | 代理人： | 劉娟 |
| 地址： | 201100 上海市閔行區元江路5*** | 國省代碼： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 磁性體 分選柱 緩沖液 上清液 標簽 特異性結合 目標細胞 取上清液 收集效率 標記物 滯留的 孵育 清液 洗脫 去除 磁場 | ||
1.一種高效的外泌體分離方法，其特征在于，所述分離方法至少包括以下步驟：
(1)通過載體向目標細胞中導入帶有標簽的CD63，導入成功后培養12～36h，然后篩選出含有CD63的陽性克隆細胞，再繼續培養陽性克隆細胞；
(2)離心前清洗細胞；對陽性克隆細胞進行離心，所述離心的條件為1000g離心5min，隨后4℃12000g；離心30min離心后取上清液，并向離心后的上清液中加入緩沖液；
(3)向上清液中加入磁性體，所述磁性體上含有能夠與CD63上的標簽特異性結合的標記物，孵育；
(4)將上清液置于磁場中；
(5)去除上清液后加入緩沖液，加入分選柱，利用緩沖液洗脫分選柱上滯留的外泌體，并收集。
2.根據權利要求1所述的外泌體分離方法，其特征在于：所述標簽選自Flag、His6、GST、MBP、His-MBP、HA中的任意一種或幾種。
3.根據權利要求1所述的外泌體分離方法，其特征在于：所述步驟(3)中孵育的溫度為2～5℃，時間15～20分鐘。
4.根據權利要求1所述的外泌體分離方法，其特征在于：所述步驟(4)將上清液置于磁場中的同時離心，離心的條件為1500～4500r/min，時間5～20min。
5.根據權利要求1所述的外泌體分離方法，其特征在于，所述步驟(1)中CD63通過pCD63-3*Flag導入目標細胞，所述pCD63-3*Flag通過載體、CD63片段和3flag片段按1:3:3的摩爾比加入到HB-infusion無縫克隆試劑獲得。
6.根據權利要求1所述的外泌體分離方法，其特征在于，所述步驟(1)中所述細胞培養基包括以下組分：
7.根據權利要求6所述外泌體的分離方法，其特征在于，所述氨基酸選自L-鹽酸精氨酸、L-鹽酸胱氨酸、甘氨酸、L-鹽酸組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-鹽酸賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸中的任意一種或幾種。
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