[發明專利]一種基因編輯系統及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201711459376.9
• 申請日: 2017-12-28
• 公開（公告）號: CN108118057B
• 公開（公告）日: 2021-04-06
• 發明（設計）人: 吳文書
• 申請（專利權）人: 吳文書
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/90;C12N9/22;A61K48/00;A61P7/04
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

本發明提供了一種基因編輯系統及其制備方法和應用，所述gRNA包括靶向凝血因子VIII基因22號內含子的核酸序列。本發明的基因編輯系統利用gRNA和Cas9蛋白靶向切割凝血因子VIII基因22號內含子，并定點定向地插入一段含有凝血因子VIII基因23?26號外顯子的人工合成序列，達到了修復凝血因子VIII基因22號內含子倒位的目的。

技術領域

本發明屬于基因編輯技術領域，涉及一種基因編輯系統及其制備方法和應用，尤其涉及一種修復凝血因子VIII基因22號內含子倒位的基因編輯系統及其制備方法和應用。

背景技術

A型血友病亦稱作甲型血友病，是臨床上最常見的血友病類型，約占血友病總數的80％-85％，在某些高發地區其比例甚至更高。A型血友病主要是由凝血因子VIII(humanfactor VIII)的缺失引起的，而凝血因子VIII基因的點突變或22號內含子倒位(Intron-22-inversion)造成了凝血因子VIII的缺失。

根據凝血因子VIII的缼失程度，A型血友病可以分為輕度血友病(5-30％凝血因子VIII)、中度血友病(2-5％凝血因子VIII)和重度血友病(1％凝血因子VIII)，發病率分別為50％、10％和40％。其中，至少50％的重度A型血友病是由22號內含子倒位造成的凝血因子VIII缺失而引起的，因此，凝血因子VIII基因的22號內含子倒位是造成血友病的最常見的突變。

目前，臨床上主要通過注射重組的凝血因子VIII治療A型血友病，然而該治療方案費用昂貴，僅能減緩癥狀，對A型血友病不具有治愈作用，而且患者容易產生抗重組的凝血因子VIII的抗體，顯著影響重組的凝血因子VIII的治療效果。

基因治療方法尚未應用于臨床，但于2016年提出的利用腺相關病毒載體(AAV)在體內表達縮小的凝血因子VIII的方法(McIntosh J,Lenting PJ,Rosales C,etal.Therapeutic levels of FVIII following a single peripheral veinadministration of rAAV vector encoding a novel human factor VIIIvariant.Blood,2013,121:3335-3344.)已開展臨床試驗，該方法是將凝血因子VIII基因由7kb減小至5.2kb，裝入腺相關病毒載體(AAV)，通過靜脈血管注射到患者體內。該方法可長久性地在患者體內表達縮小的凝血因子VIII，但不具有永久性，并且不能表達全長的凝血因子VIII，患者容易產生抗縮小的凝血因子VIII的抗體，影響凝血功能。

因此，提供一種修復凝血因子VIII基因的22號內含子倒位的產品和方法，從根本上修復凝血因子VIII基因22號內含子倒位，具有重要意義。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明提供一種基因編輯系統及其制備方法和應用，所述基因編輯系統利用gRNA和Cas9蛋白靶向切割凝血因子VIII基因22號內含子，并定點定向地插入一段含有凝血因子VIII基因23-26號外顯子的人工合成序列，達到修復凝血因子VIII基因22號內含子倒位的目的。

為達此目的，本發明采用以下技術方案：

第一方面，本發明提供了一種gRNA，所述gRNA包括靶向凝血因子VIII基因22號內含子的核酸序列。

本發明中，所述gRNA具有特異性靶向凝血因子VIII基因22號內含子的作用，可以介導Cas9蛋白對凝血因子VIII基因22號內含子進行切割。

優選地，所述gRNA的核酸序列如SEQ ID NO.1-2所示，所述SEQ ID NO.1-2所示的核酸序列如下：

SEQ ID NO.1：5’-TGTGGCAACAGCGGTATAAATGG-3’；