[發(fā)明專利]一種同時檢測ALV和REV抗體的試劑盒及方法

在審

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• 申請日: 2017-12-28
• 公開（公告）號: CN107991482A
• 公開（公告）日: 2018-05-04
• 發(fā)明（設計）人: 潘玉
• 申請（專利權）人: 廣州維佰生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 廣州市科豐知識產權代理事務所(普通合伙)44467
• 代理人: 王海曼

技術領域

本發(fā)明涉及一種同時檢測ALV和REV抗體的試劑盒，本發(fā)明還涉及該試劑盒的制備方法與應用，屬于生物檢測技術領域。

背景技術

禽白血病(avian leukemia，AL)是由禽白血病病毒(avian leukemia virus，ALV)引起的家禽腫瘤性疾病。要是淋巴細胞性白血病，其次是成紅細胞性白血病、成髓細胞性白血病。此外還可引起骨髓細胞瘤、結締組織瘤、上皮腫瘤、內皮腫瘤等。大多數(shù)腫瘤侵害造血系統(tǒng)，少數(shù)侵害其他組織。ALV在各類雞群都廣泛性感染，包括白雞、蛋雞和地方黃雞。對ALV的防控措施，只有通過疾病凈化，沒有其它更好的捷徑。ALV既可以水平傳播，也可以垂直傳播。

雞網狀內皮組織增生病是由雞網狀內皮組織增生癥病毒(REV)引起的，其急性型表現(xiàn)為死前嗜睡。慢性型表現(xiàn)為矮小綜合征，生長發(fā)育停滯，羽毛生長不良，冠髯蒼白。運動失調，肢體麻痹。

ALV與REV屬于禽免疫抑制病原，此類病原的感染呈逐年上升趨勢。禽的免疫抑制病原會使雞群對其它病毒或細菌變得更為易感，而且使其感染的癥狀、病變不典型。在臨床上多重病毒混合感染的情況非常普遍，容易造成誤診，其鑒別診斷通常需借助實驗室診斷技術，如：病毒的分離和鑒定、血清學試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗以及分子生物學診斷等。傳統(tǒng)經典的病毒分離方法操作復雜、耗時、費力。部分血清學檢測方法敏感性低，特異性差，而且操作方法繁瑣，一次只能檢測一種病原。不利于疾病的及時診斷治療，造成重大的經濟損失。

發(fā)明內容

針對上述問題，本發(fā)明的第一個目的是提供一種同時檢測ALV和REV抗體的試劑盒；本發(fā)明的第二個目的是提供上述試劑盒的制備方法。本發(fā)明的第三目的是提供同時檢測 ALV和REV抗體的試劑盒的應用。

為此，本發(fā)明提供的第一個技術方案是這樣的：

一種同時檢測ALV和REV抗體的試劑盒，包被有REV env蛋白的xMAP磁珠、包被有ALV p27蛋白的xMAP磁珠，ALV陽性血清、ALV陰性血清、REV陽性血清、REV 陰性血清、生物素標記的山羊抗雞IgY多克隆抗體、鏈霉親和素藻紅蛋白、PBS/TBN緩沖液。

本發(fā)明提供的第二個技術方案是這樣的：

進一步，上述的一種同時檢測ALV和REV抗體的試劑盒的制備方法，所述的制備包被有ALV p27蛋白的xMAP磁珠依次包括下述步驟：

1)提取ALV、REV病毒核酸；

2)構建重組抗原表達質粒

對步驟1)提取的病毒核酸分別進行RT-PCR擴增；擴增結束后均回收純化PCR產物，用限制性內切酶于37℃雙酶切3h；酶切產物進行電泳回收，分別與同樣經雙酶切后的質粒pET28a連接，轉化DH 5α感受態(tài)細菌，轉化平板上挑取單個菌落進行PCR及酶切鑒定，陽性菌落進行測序鑒定；測序正確質粒轉入感受態(tài)BL21進行誘導表達；

3)SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達

收集步驟2)誘導后的重組子，冰上冷卻，12000rpm離心2min，細胞沉淀用PBS/TBN 洗滌一次，再次離心收集沉淀，在沉淀中加入50μLPBS/TBN進行超聲破碎后離心分上清和沉淀，沉淀用尿素溶解，將二者煮沸5min，取20uL直接用于SDS-PAGE；

4)重組蛋白親和層析純化

5)抗原偶聯(lián)磁珠。

進一步，上述的一種同時檢測ALV和REV抗體的試劑盒的制備方法，步驟2)RT-PCR 擴增時的反應體系：一步法PCR酶混合液2μl；2×1一步法PCR緩沖液，12.5μl；核苷酸序列SEQ ID NO：1所示的上游引物10μM，1μl；核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的的下游引物10μM，1μl；RNA，2.5μl；或者是核苷酸序列SEQ ID NO：3所示的上游引物10μM，1μl；核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的的下游引物10μM，1μl；RNA，2.5 μl；無RNA酶dH2O，Up to 25μl；RT-PCR擴增時的反應程序：反轉錄50℃，30min，預變性95℃，15min，一個循環(huán)；變性94℃，30S，退火55℃，30S，延伸72℃，50S， 35個循環(huán)；再延伸72℃，10min。

進一步的，述的一種同時檢測ALV和REV抗體的試劑盒的制備方法，抗原偶聯(lián)磁珠包括如下步驟：

1)將磁珠放置室溫平衡20分鐘后，渦旋、超聲20s，重懸磁珠；

2)將磁珠轉移到USA Scientific microcentrifuge低結合律試管中，12000rpm離心3min，沉淀磁珠，并去除上清；