[發明專利]一種同時檢測ALV和REV抗體的試劑盒及方法

在審

• 申請號: 201711457107.9
• 申請日: 2017-12-28
• 公開（公告）號: CN107991482A
• 公開（公告）日: 2018-05-04
• 發明（設計）人: 潘玉
• 申請（專利權）人: 廣州維佰生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 廣州市科豐知識產權代理事務所(普通合伙)44467
• 代理人: 王海曼

1.一種同時檢測ALV和REV抗體的試劑盒，其特征在于，包被有REV env蛋白的xMAP磁珠、包被有ALV p27蛋白的xMAP磁珠，ALV陽性血清、ALV陰性血清、REV陽性血清、REV陰性血清、生物素標記的山羊抗雞IgY多克隆抗體、鏈霉親和素藻紅蛋白、PBS/TBN緩沖液。

2.制備權利要求1所述的一種同時檢測ALV和REV抗體的試劑盒，依次包括下述步驟：

1)分別制備包被有ALV p27蛋白的xMAP磁珠和包被REV env蛋白的xMAP磁珠；

2)將步驟1)制備的包被有ALV p27蛋白的xMAP磁珠、包被有REV env蛋白的xMAP磁珠和ALV陽性血清、ALV陰性血清、REV陽性血清、REV陰性血清、生物素標記的山羊抗雞IgY多克隆抗體、鏈霉親和素藻紅蛋白、PBS/TBN緩沖液放入盒體內。

3.根據權利要求2所述的一種同時檢測ALV和REV抗體的試劑盒的制備方法，其特征在于，所述的制備包被有ALV p27蛋白的xMAP磁珠依次包括下述步驟：

1)提取ALV、REV病毒核酸；

2)構建重組抗原表達質粒

對步驟1)提取的病毒核酸分別進行RT-PCR擴增；擴增結束后均回收純化PCR產物，用限制性內切酶于37℃雙酶切3h；酶切產物進行電泳回收，分別與同樣經雙酶切后的質粒pET28a連接，轉化DH 5α感受態細菌，轉化平板上挑取單個菌落進行PCR及酶切鑒定，陽性菌落進行測序鑒定；測序正確質粒轉入感受態BL21進行誘導表達；

3)SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達

收集步驟2)誘導后的重組子，冰上冷卻，12000rpm離心2min，細胞沉淀用PBS/TBN洗滌一次，再次離心收集沉淀，在沉淀中加入50μLPBS/TBN進行超聲破碎后離心分上清和沉淀，沉淀用尿素溶解，將二者煮沸5min，取20uL直接用于SDS-PAGE；

4)重組蛋白親和層析純化

5)抗原偶聯磁珠。

4.根據權利要求3所述的一種同時檢測ALV和REV抗體的試劑盒的制備方法，其特征在于，步驟2)RT-PCR擴增時的反應體系：一步法PCR酶混合液2μl；2×1一步法PCR緩沖液，12.5μl；核苷酸序列SEQ ID NO：1所示的上游引物10μM，1μl；核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的的下游引物10μM，1μl；RNA，2.5μl；或者是核苷酸序列SEQ ID NO：3所示的上游引物10μM，1μl；核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的的下游引物10μM，1μl；RNA，2.5μl；無RNA酶dH2O，Up to 25μl；RT-PCR擴增時的反應程序：反轉錄50℃，30min，預變性95℃，15min，一個循環；變性94℃，30S，退火55℃，30S，延伸72℃，50S，35個循環；再延伸72℃，10min。