[發明專利]一種重組胱抑素C蛋白及其在檢測試劑盒中的應用

在審

• 申請號: 201711454926.8
• 申請日: 2017-12-28
• 公開（公告）號: CN109975552A
• 公開（公告）日: 2019-07-05
• 發明（設計）人: 馬永;楊蕓;趙利利;王安良
• 申請（專利權）人: 江蘇眾紅生物工程創藥研究院有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/96;G01N33/543
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種重組胱抑素C蛋白，其特征在于，所述重組胱抑素C蛋白的編碼基因序列如SEQID NO：2所示。

2.包含了如權利要求1所述編碼rhCysC的基因的載體，所述的載體為pTWIN1。

3.包含了如權利要求2所述載體的大腸桿菌宿主菌株，所述宿主菌株選為BL21(DE3)。

4.一種重組胱抑素C蛋白在大腸桿菌中高效可溶表達方法，包括如下步驟：

1).挑取一個含有上述所述的重組大腸桿菌單菌落，接入LB培養液，培養過夜；

2).取過夜培養物接入LB培養液中，震蕩培養至對數中期(OD₆₀₀＝0.8～1.0)；

3).在培養物中加入IPTG至0.5mmol/L，誘導表達，離心收集含有重組胱抑素C蛋白的大腸桿菌菌體沉淀；

4).將收集得到的菌體沉淀離心、破碎后，以幾丁質珠親和層析得到純重組胱抑素C蛋白樣品。

5.一種兔抗人胱抑素C多克隆抗體，其特征在于，所述抗體用權利要求1所述的重組胱抑素C蛋白作為免疫原制備得到。

6.一種檢測人胱抑素C的膠乳增強免疫比濁檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含如權利要求1的重組胱抑素C蛋白、如權利要求5所述的兔抗人胱抑素C多克隆抗體。

7.如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含R1試劑、R2試劑和標準品，所述R1試劑包括：緩沖液、穩定劑、增凝劑、保護劑、防腐劑、螯合劑；所述R2試劑包括：緩沖液2、防腐劑、穩定劑、保護劑；所述標準品包括：緩沖液3、保護劑、穩定劑。

8.如權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述R1試劑中：緩沖液為0.02M-0.05M、pH7.0-7.4的磷酸鹽緩沖液；穩定劑為40g/L-100g/L的NaCl或KCl；增凝劑為10-20g/L的PEG，保護劑為20g/L-40g/L的BSA，防腐劑為0.1-0.3g/L的Proclin300，螯合劑為0.1g/L-0.8g/L的EDTA；

所述R2試劑中：緩沖液為0.02M-0.05M、pH7.0-7.4的磷酸鹽緩沖液；防腐劑為0.1-0.3g/L的Proclin300；穩定劑為10g/L-20g/L的NaCl或KCl，和50-100g/L的蔗糖或葡萄糖，保護劑為20g/L-40g/L的BSA；另外有標記有胱抑素C抗體的膠乳微球(質量濃度為0.2％)；

所述標準品包括6支不同濃度的胱抑素C重組蛋白的溶液，其中：緩沖液為0.02M-0.05M、pH7.0-7.4的磷酸鹽緩沖液；保護劑為1g/L-10g/L的BSA，穩定劑9-13g/L的NaCl。

9.如權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，標記有胱抑素C抗體的膠乳微球制備方法包括如下步驟：

將權利要求5所述的胱抑素C抗體在4℃條件下進行透析，再用MES緩沖液將抗體稀釋至2mg/mL，制備成抗體稀釋液；用MES緩沖液將聚苯乙烯膠乳微球稀釋至1％(質量濃度)，再加入0.5％-2％(質量濃度)的EDC，在30℃下攪拌反應30min，反應結束后通過離心去除未反應的EDC，然后加入抗體稀釋液，在30℃下攪拌反應60min，反應結束后通過離心去除未反應的抗體，再加入終止反應液終止反應即得。