[發明專利]一種重組胱抑素C蛋白及其在檢測試劑盒中的應用

在審

• 申請號: 201711454926.8
• 申請日: 2017-12-28
• 公開（公告）號: CN109975552A
• 公開（公告）日: 2019-07-05
• 發明（設計）人: 馬永;楊蕓;趙利利;王安良
• 申請（專利權）人: 江蘇眾紅生物工程創藥研究院有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/96;G01N33/543
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本發明涉及一種重組胱抑素C蛋白(rhCysC)及其在檢測血清中胱抑素C(CysC)檢測試劑盒中的應用，屬于醫學免疫體外診斷領域。本發明提供了專為大腸桿菌表達系統進行密碼子優化得到的編碼rhCysC的基因序列，序列如SEQ ID NO：2所示。通過轉入該序列能夠顯著提高異源基因在宿主菌中的表達效率。本發明rhCysC的重組表達方法具有周期短、表達量大、成本低的特點，且通過該方法制備出的rhCysC可以作為一種有效的免疫原，用于兔多抗的制備，并將該種多抗用于膠乳增強免疫比濁檢測試劑盒的制備中，能夠準確檢測出血清中CysC含量，與市售產品相比，具有更好的重復性和更高的準確度，顯現出較好的臨床應用前景。

技術領域

本發明屬于醫學免疫體外診斷領域，尤其是一種重組胱抑素C蛋白及其在檢測血清中胱抑素C(CysC)含量的檢測試劑盒中的應用。

背景技術

胱抑素C是一種帶正電荷的堿性分泌蛋白，分子量為13KD，廣泛存在于各種體液中，如精液、唾液、尿液等，無組織特異性。胱抑素C能自由從腎小球濾過，在近曲小管被重新吸收后，被上皮細胞完全代謝分解，不重新回到血液中，因此腎臟是循環中清除CysC的唯一器官，腎小球濾過率(GFR)決定血清中CysC濃度。CysC的生成不受年齡、性別、體重、炎癥等因素的影響，是迄今反映GFR變化的理想內源性標志物。目前研究顯示干擾CysC測定的物質比較少，使得其測定結果具有很高的可靠性和真實性。因為GFR是反映腎功能的最重要指標，所以近些年CysC憑借敏感性好、特異性高的優勢，發展成為評估腎功能的一個重要指標。現在許多文獻資料相繼報道，胱抑素C(CysC)還廣泛應用于心血管系統、內分泌系統、泌尿外科、神經系統等的檢測中，具有重要的臨床意義。

當前有多種途徑可以獲取CysC蛋白，其中利用基因工程途徑主要有原核和真核表達方法。但是真核表達存在成本比較高，制備工序比較復雜的劣勢，導致其不適合用于CysC的大批量制備。而原核表達相對而言，卻比較簡單。考慮到CysC蛋白是非糖基化蛋白，對翻譯后修飾的要求不高，且作為免疫原，對生物活性要求也不高。所以采用原核表達策略是完全可行的。大腸桿菌的遺傳背景清楚，培養方法簡單，生長周期短，成本低，使得其是表達蛋白質的理想工具，但也存在天然編碼序列不易克隆的操作困難。本發明根據大腸桿菌同義密碼子偏好性，對天然編碼序列進行優化，在不影響重組CysC蛋白正確性的前提下，成功提高表達產量，也為本發明的抗體制備及產業化應用打下了基礎。

目前臨床對CysC的檢測方法主要有酶聯免疫吸附測定法、化學發光法、免疫比濁法，這些方法都是基于免疫學，利用抗原抗體的特異性結合，定量檢測血清中CysC含量。前兩種方法由于費用高或操作繁瑣、周期長等劣勢，阻礙了其在臨床上廣泛使用，而隨著全自動生化分析儀的普及，生化比濁法具備反應時間短，精密度好，易于自動化等優點，成為臨床上主流檢測方法。免疫比濁法由于缺乏級聯放大效應，使得靈敏度較低，但是本發明采用膠乳增強免疫比濁法，借助包被了兔多抗的“膠乳”介質，顯著增大抗原抗體反應物的粒徑，提高了檢測靈敏度和精密度。

發明內容

本發明提供了一種重組胱抑素C蛋白(以下簡稱rhCysC)，其氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示。

本發明提供了編碼上述所述rhCysC的基因，其堿基序列如SEQ ID NO：2所示。該序列是專為大腸桿菌表達系統進行密碼子優化得到的序列，能夠顯著提高異源基因在宿主菌中的表達效率。

本發明還提供了包含了上述所述編碼rhCysC的基因的載體，所述的載體優選為原核表達載體pET21b、pET28a、pTWIN1，特別優選為pTWIN1作為rhCysC高效可溶表達的載體。

本發明還提供了包含有上述所述載體的大腸桿菌宿主菌株，優選地，所述宿主菌株選自大腸桿菌BL21(DE3)或BL21(AI)菌株，特別優選為BL21(DE3)作為rhCysC高效可溶表達的宿主菌株。

本發明還提供了rhCysC在大腸桿菌中高效可溶表達方法，包括如下步驟：