[發明專利]一種GS表達系統細胞株的篩選方法

有效

• 申請號: 201711452716.5
• 申請日: 2017-12-28
• 公開（公告）號: CN108085337B
• 公開（公告）日: 2020-10-16
• 發明（設計）人: 張文宇;馬燕玲;阮卡;鄒有土;王明灶;葛平輝;章永壘;陳星
• 申請（專利權）人: 未名生物醫藥有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/64;C12N5/10
• 代理公司: 廈門市精誠新創知識產權代理有限公司 35218
• 代理人: 秦華

本發明公開了一種GS表達系統細胞株的篩選方法，篩選步驟為將含目的基因的表達載體轉染宿主細胞后在蛋氨酸亞氨基代砜加壓條件下，于37℃，5％CO₂培養箱中培養3～4周,檢測發酵液表達量，篩選陽性克隆細胞，放大培養到細胞活率達到85％以上，再用有限稀釋法進行單克隆化篩選，篩選時需同時在96孔板中加入密度為1×10⁴～1×10⁵個/孔的宿主細胞并于37℃，5％CO₂培養箱中培養3～5周后，篩選出陽性單克隆細胞株，即得GS表達系統細胞株。本發明所述篩選方法，克隆化時加入密度為1×10⁴～1×10⁵個/孔的宿主飼養細胞，克隆效率平均可達到22.1％，單克隆化效率大幅提升。

技術領域

本發明涉及細胞工程領域，特別是一種GS表達系統細胞株的篩選方法。

背景技術

谷氨酰胺合成酶(GS)催化谷氨酸和氨合成谷氨酰胺，在哺乳動物體內這是谷氨酰胺形成的唯一途徑。在不含谷氨酰胺的培養基中，GS對哺乳動物細胞的存活是必不可少的。一些哺乳動物細胞系，如小鼠骨髓瘤細胞，不能表達足夠的GS，在沒有額外添加谷氨酰胺時不能存活。而另外一些細胞系，如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)，可以表達足夠的GS來存活，不需要額外添加谷氨酰胺。在這種情況下，可以用GS抑制劑蛋氨酸亞氨基代砜(methioninesulfoximine,MSX)來抑制內源性的GS活性，只有含外源GS基因的轉染細胞才可以存活。

谷氨酰胺合成酶(GS)表達系統將外源基因插入到含有GS基因表達載體的下游，是生物制藥行業廣泛應用的哺乳動物表達系統之一。宿主細胞可以選擇內源性不表達GS基因的重組鼠骨髓瘤細胞NSO、內源性表達GS基因的中國倉鼠卵巢細胞CHOK1或Lonza公司開發的CHOK1衍生細胞——CHOK1SV。CHOK1SV細胞表達內源性的GS基因，因此陽性轉染子需要在MSX加壓和無谷氨酰胺培養基的雙重篩選中獲得。

獲得穩定高產的細胞株的常規篩選步驟為：構建表達載體、轉染宿主細胞、加壓篩選獲得陽性多克隆細胞株、細胞株單克隆化、高表達單克隆細胞株的獲得及質量評估。

單克隆化篩選最常用的方法為有限稀釋法(limiting dilution cloning，LDC)，主要步驟為在加壓條件下以1個/孔或小于1個/孔的細胞密度將多克隆細胞接種到96孔板中培養，待單細胞形成明顯的單集落時檢測表達量，篩選出陽性高表達的單克隆細胞株。

有限稀釋法不需要任何特殊的設備，成本低且易于操作。但該方法對細胞生長狀態要求較高，克隆效率極低。M.Celina de la Cruz Edmonds等人有限稀釋法篩選細胞時，當接種細胞數為6.25×10²到2.5×10³個/孔時，克隆形成率為0.01％～0.6％，當接種密度為5×10³到1×10⁴個/孔時，克隆形成率也僅為2％～4％。

發明內容

本發明的目的在于提供一種GS表達系統細胞株的高效的篩選方法。

為實現上述目的，本發明提供一種GS表達系統細胞株的篩選方法，篩選步驟如下：

S1：含目的基因的表達載體轉染宿主細胞后在蛋氨酸亞氨基代砜加壓條件下，于37℃，5％CO₂培養箱中培養3～4周,檢測發酵液表達量，篩選陽性克隆細胞；將所得的陽性克隆細胞放大培養到細胞活率達到85％以上；

S2：對S1所得陽性克隆細胞用有限稀釋法進行單克隆化篩選，篩選時需在96孔板中加入密度為1×10⁴～1×10⁵個/孔的宿主細胞并于37℃，5％CO₂培養箱中培養，3～5周后觀察96孔板中細胞生長情況，標記出單克隆孔，檢測發酵液表達量，篩選出陽性單克隆細胞株，即得GS表達系統細胞株。