[發明專利]一種從混合物中分離天然序列神經生長因子的方法

有效

• 申請號: 201711452346.5
• 申請日: 2017-12-28
• 公開（公告）號: CN107973848B
• 公開（公告）日: 2020-10-16
• 發明（設計）人: 張文宇;黃奮飛;陳振雄;馬大壯;章永壘;陳星
• 申請（專利權）人: 未名生物醫藥有限公司
• 主分類號: C07K14/48
• 分類號: C07K14/48;C07K1/18
• 代理公司: 廈門市精誠新創知識產權代理有限公司 35218
• 代理人: 秦華

本發明公開了一種從混合物中分離天然序列神經生長因子的方法。即從含有人或鼠神經生長因子的溶液中，采用金屬離子螯合層析進行分離純化，得到天然序列神經生長因子；所述金屬離子螯合層析樹脂由支持介質、螯合配基和金屬離子組成；所述金屬離子螯合于螯合配基上；所述洗脫的條件為改變蛋白質與金屬離子配位結合的競爭性物質濃度梯度。還可以在金屬離子螯合層析前，先進行強陽離子交換層析；在金屬離子螯合層析后，再進行高效強陽離子交換層析。采用本發明的方法可快速純化分離天然序列、不帶任何蛋白標簽的神經生長因子。

技術領域

本發明涉及生物技術純化領域，尤其涉及一種從混合物中分離天然序列神經生長因子的方法。

背景技術

神經生長因子(NGF)是最早發現的神經系統營養因子，其作用廣泛，對中樞和周圍神經細胞的生長、發育、分化及再生具有重要作用，其中β亞單位是NGF的活性區。通常所說的β-NGF是118個氨基酸成熟肽。在人體內，β-NGF的表達有下列過程：1.β-NGF編碼序列(723bp)翻譯為prepro-NGF(241aa)，包括信號肽(1-18aa)、導肽(19-121aa)、成熟肽(122-241aa)；2.內質網上，信號肽被水解，形成pro-NGF，包括導肽與成熟肽。導肽末端有4個氨基酸殘基(118-121aa)Arg-Ser-Lys-Arg，為哺乳動物前提蛋白加工酶識別位點，導肽在高爾基體中被前體蛋白加工酶水解，形成NGF(120aa)；3.NGF在7S NGF中γ亞基作用下切除C端的ArgAla形成成熟肽(118aa)。目前商品化的神經生長因子藥物為鼠源β-mNGF如(NOBEX)，是從成年雄性小鼠頜下腺分離和純化獲得。廣泛應用于眼科、神經外科、骨科、神經內科、兒科、內分泌科神經萎縮、神經變性、外傷修復等疾病的治療。

雖然鼠源神經生長因子(mNGF)與人源神經生長因子(hNGF)具有極高的同源性，但動物源性的蛋白質存在潛在的免疫原性，且生產需要大量的合格的雄性小鼠頜下腺。因此開發基因工程技術重組表達hNGF的制備方法，將是未來NGF藥物研發的趨勢。在眾多表達系統中，相對于原核表達系統、酵母表達系統、昆蟲細胞表達系統等，哺乳動物細胞表達系統具有許多優勢，例如正確有效的翻譯后修飾，使蛋白質能正確得折疊成最接近天然分子的結構；能有效分泌蛋白質至細胞外，且宿主本底表達較低，利于純化等。

無論是動物組織來源或重組表達的β-NGF，均含有雜蛋白、多聚體、水解誤加工形式的β-NGF變體、電荷異構體等不同形式的污染物或β-NGF變體，這些不同形式的β-NGF變體大大影響了β-NGF活性。開發一種將天然118aa序列的β-NGF從這些污染物及錯誤變體形式中分離出來的方法，是獲得高質量重組β-hNGF或動物源β-NGF的關鍵。

現有市場上的NGF為鼠源且是動物組織提取，存在免疫原性、鼠源病毒等風險。無論是動物組織提取的β-NGF，還是重組表達的β-NGF，都存在有多種變體，比如水解誤加工變體、多聚體、電荷異構體。現有的β-NGF純化技術方案缺點有：難以除去水解誤加工變體，產品中存在氨基酸序列截短的NGF；難以除去各種電荷異構體(比如氨基甲酰化、氧化、異天冬氨酸、脫酰胺化等形式)。或者可以制備變體較少的β-NGF，但需要多個層析步驟，例如離子交換層析-疏水作用層析-高效離子交換層析-反向層析，而且反向層析應用到有機試劑，容易使蛋白變性。水解誤加工變體，缺失了部分對NGF活性起關鍵作用的氨基酸殘基，大大影響活性。有效去除水解誤加工變體可以提高活性。中國專利CN 1268639C中認為疏水作用層析可以去除水解誤加工變體。

現有分離提取神經生長因子的技術方法中，存在著難以分離水解誤加工變體、電荷異構體的技術難點，分離得到的神經生長因子存在著多種影響活性的變體。抑或為了獲得變體含量較少的神經生長因子，需要通過多個層析步驟方才實現，例如通過疏水作用層析、離子交換層析、反向層析等四步層析方法，且反向層析過程中的有機試劑影響活性。