[發(fā)明專利]一種從混合物中分離天然序列神經(jīng)生長因子的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711452346.5
• 申請日: 2017-12-28
• 公開（公告）號: CN107973848B
• 公開（公告）日: 2020-10-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張文宇;黃奮飛;陳振雄;馬大壯;章永壘;陳星
• 申請（專利權(quán)）人: 未名生物醫(yī)藥有限公司
• 主分類號: C07K14/48
• 分類號: C07K14/48;C07K1/18
• 代理公司: 廈門市精誠新創(chuàng)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 35218
• 代理人: 秦華

本發(fā)明公開了一種從混合物中分離天然序列神經(jīng)生長因子的方法。即從含有人或鼠神經(jīng)生長因子的溶液中，采用金屬離子螯合層析進行分離純化，得到天然序列神經(jīng)生長因子；所述金屬離子螯合層析樹脂由支持介質(zhì)、螯合配基和金屬離子組成；所述金屬離子螯合于螯合配基上；所述洗脫的條件為改變蛋白質(zhì)與金屬離子配位結(jié)合的競爭性物質(zhì)濃度梯度。還可以在金屬離子螯合層析前，先進行強陽離子交換層析；在金屬離子螯合層析后，再進行高效強陽離子交換層析。采用本發(fā)明的方法可快速純化分離天然序列、不帶任何蛋白標簽的神經(jīng)生長因子。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)純化領(lǐng)域，尤其涉及一種從混合物中分離天然序列神經(jīng)生長因子的方法。

背景技術(shù)

神經(jīng)生長因子(NGF)是最早發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)營養(yǎng)因子，其作用廣泛，對中樞和周圍神經(jīng)細胞的生長、發(fā)育、分化及再生具有重要作用，其中β亞單位是NGF的活性區(qū)。通常所說的β-NGF是118個氨基酸成熟肽。在人體內(nèi)，β-NGF的表達有下列過程：1.β-NGF編碼序列(723bp)翻譯為prepro-NGF(241aa)，包括信號肽(1-18aa)、導肽(19-121aa)、成熟肽(122-241aa)；2.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，信號肽被水解，形成pro-NGF，包括導肽與成熟肽。導肽末端有4個氨基酸殘基(118-121aa)Arg-Ser-Lys-Arg，為哺乳動物前提蛋白加工酶識別位點，導肽在高爾基體中被前體蛋白加工酶水解，形成NGF(120aa)；3.NGF在7S NGF中γ亞基作用下切除C端的ArgAla形成成熟肽(118aa)。目前商品化的神經(jīng)生長因子藥物為鼠源β-mNGF如(NOBEX)，是從成年雄性小鼠頜下腺分離和純化獲得。廣泛應(yīng)用于眼科、神經(jīng)外科、骨科、神經(jīng)內(nèi)科、兒科、內(nèi)分泌科神經(jīng)萎縮、神經(jīng)變性、外傷修復等疾病的治療。

雖然鼠源神經(jīng)生長因子(mNGF)與人源神經(jīng)生長因子(hNGF)具有極高的同源性，但動物源性的蛋白質(zhì)存在潛在的免疫原性，且生產(chǎn)需要大量的合格的雄性小鼠頜下腺。因此開發(fā)基因工程技術(shù)重組表達hNGF的制備方法，將是未來NGF藥物研發(fā)的趨勢。在眾多表達系統(tǒng)中，相對于原核表達系統(tǒng)、酵母表達系統(tǒng)、昆蟲細胞表達系統(tǒng)等，哺乳動物細胞表達系統(tǒng)具有許多優(yōu)勢，例如正確有效的翻譯后修飾，使蛋白質(zhì)能正確得折疊成最接近天然分子的結(jié)構(gòu)；能有效分泌蛋白質(zhì)至細胞外，且宿主本底表達較低，利于純化等。

無論是動物組織來源或重組表達的β-NGF，均含有雜蛋白、多聚體、水解誤加工形式的β-NGF變體、電荷異構(gòu)體等不同形式的污染物或β-NGF變體，這些不同形式的β-NGF變體大大影響了β-NGF活性。開發(fā)一種將天然118aa序列的β-NGF從這些污染物及錯誤變體形式中分離出來的方法，是獲得高質(zhì)量重組β-hNGF或動物源β-NGF的關(guān)鍵。

現(xiàn)有市場上的NGF為鼠源且是動物組織提取，存在免疫原性、鼠源病毒等風險。無論是動物組織提取的β-NGF，還是重組表達的β-NGF，都存在有多種變體，比如水解誤加工變體、多聚體、電荷異構(gòu)體。現(xiàn)有的β-NGF純化技術(shù)方案缺點有：難以除去水解誤加工變體，產(chǎn)品中存在氨基酸序列截短的NGF；難以除去各種電荷異構(gòu)體(比如氨基甲酰化、氧化、異天冬氨酸、脫酰胺化等形式)。或者可以制備變體較少的β-NGF，但需要多個層析步驟，例如離子交換層析-疏水作用層析-高效離子交換層析-反向?qū)游觯曳聪驅(qū)游鰬?yīng)用到有機試劑，容易使蛋白變性。水解誤加工變體，缺失了部分對NGF活性起關(guān)鍵作用的氨基酸殘基，大大影響活性。有效去除水解誤加工變體可以提高活性。中國專利CN 1268639C中認為疏水作用層析可以去除水解誤加工變體。

現(xiàn)有分離提取神經(jīng)生長因子的技術(shù)方法中，存在著難以分離水解誤加工變體、電荷異構(gòu)體的技術(shù)難點，分離得到的神經(jīng)生長因子存在著多種影響活性的變體。抑或為了獲得變體含量較少的神經(jīng)生長因子，需要通過多個層析步驟方才實現(xiàn)，例如通過疏水作用層析、離子交換層析、反向?qū)游龅人牟綄游龇椒ǎ曳聪驅(qū)游鲞^程中的有機試劑影響活性。