[發(fā)明專(zhuān)利]一種ERCC2基因的rs13181位點(diǎn)SNP核酸質(zhì)譜檢測(cè)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711450591.2
• 申請(qǐng)日: 2017-12-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108070660A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-05-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 聶宵;林茂俊;張鵬;劉曉霞;白楊楊
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 沃森克里克（北京）生物科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6886
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6886;C12N15/11;G01N27/62
• 代理公司: 北京愛(ài)普納杰專(zhuān)利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 王玉松

本發(fā)明提供了一種ERCC2基因rs13181位點(diǎn)SNP核酸質(zhì)譜檢測(cè)方法，首先通過(guò)第一步PCR反應(yīng)擴(kuò)增出含有SNP位點(diǎn)的片段，而非單獨(dú)擴(kuò)增SNP位點(diǎn)，以提高樣品的可操作性以及后續(xù)操作的精度；通過(guò)SAP對(duì)步驟S1得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行去磷酸化處理，防止DNA分子5'端與3'端連接，在后續(xù)步驟準(zhǔn)備好之前讓DNA分子保持線性狀態(tài)，從而保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度；最后通過(guò)步驟S3對(duì)rs13181位點(diǎn)進(jìn)行單堿基延伸，利用變性?退火內(nèi)循環(huán)使DNA雙鏈充分解螺旋、分離，從而實(shí)現(xiàn)不同SNP的精確分型。通過(guò)上述方法，可以快速、準(zhǔn)確地獲得ERCC2基因rs13181位點(diǎn)的SNP分型信息，操作簡(jiǎn)便、可靠性強(qiáng)，可以為后續(xù)的相關(guān)研究提供可靠的參考信息。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于SNP檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種ERCC2基因的rs13181位點(diǎn)SNP核酸質(zhì)譜檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP),主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。它是人類(lèi)可遺傳的變異中最常見(jiàn)的一種。占所有已知多態(tài)性的90％以上。SNP在人類(lèi)基因組中廣泛存在，平均每500～1000個(gè)堿基對(duì)中就有1個(gè)，估計(jì)其總數(shù)可達(dá)300萬(wàn)個(gè)甚至更多。

ERCC2基因又稱(chēng)DNA切除修復(fù)基因，位于19號(hào)染色體13.2～13.3處，是核苷酸切除修復(fù)通路中的重要基因。ERCC2基因具有多種功能，一方面參與核苷酸切除修復(fù)途徑，并且可以在使用鉑類(lèi)藥物化療過(guò)程中取出鉑-DNA加合物；另一方面其編碼的蛋白還參與組成Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物及p53介導(dǎo)的凋亡反應(yīng)，同時(shí)還參與基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄。

ERCC2基因上存在中多SNP位點(diǎn)，每個(gè)SNP位點(diǎn)的不同表達(dá)形式均可能對(duì)上述病癥產(chǎn)生不同的影響。其中rs13181位點(diǎn)的野生型為T(mén)T，同時(shí)還存在GT和GG兩種形式的突變型。目前已有研究表明，這兩種突變型均會(huì)增加皮膚黑色素瘤的患病風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)GG型還可能與卵巢癌的發(fā)生存在相關(guān)性。因此，提供一種高效、準(zhǔn)確的SNP檢測(cè)方法，將會(huì)為研究ERCC2對(duì)上述疾病的影響機(jī)制提供重要的參考信息和理論支持。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種ERCC2基因的rs13181位點(diǎn)SNP核酸質(zhì)譜檢測(cè)方法。

本發(fā)明具體技術(shù)方案如下：

本發(fā)明一方面提供了一種ERCC2基因的rs13181位點(diǎn)SNP核酸質(zhì)譜檢測(cè)引物組，包括如下引物：

上游引物rs13181-F：5`-ACGTTGGATGTAAGACCTTCTAGCACC ACC-3`(如SEQ.ID.No.1所示)；

下游引物rs13181-R：5`-ACGTTGGATGAGCAGCTAGAATCAGAG GAG-3`(如SEQ.ID.No.2所示)；

延伸引物rs13181-E：5`-CAATCTGCTCTATCCTCT-3`(如SEQ.ID.No.3所示)；

ERCC2基因的rs13181位點(diǎn)野生型堿基序列如SEQ.ID.No.4所示。

本發(fā)明另一方面提供了一種應(yīng)用該引物組的ERCC2基因rs13181位點(diǎn)SNP核酸質(zhì)譜檢測(cè)方法，包括如下步驟：

S1：用上游引物rs13181-F和下游引物rs13181-R進(jìn)行第一輪PCR，對(duì)模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增，得到含有所述rs13181位點(diǎn)的片段；

S2：對(duì)步驟S1得到的片段進(jìn)行去磷酸化處理，得到脫磷酸片段；

S3：用延伸引物rs13181-E對(duì)所述脫磷酸片段進(jìn)行單堿基延伸，對(duì)不同SNP進(jìn)行分型；

S4：對(duì)步驟S3得到的樣品進(jìn)行脫鹽處理，用質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)。

進(jìn)一步地，步驟S1中，第一輪PCR的反應(yīng)體系中包括如下組分：