[發(fā)明專利]一種ERCC2基因的rs13181位點SNP核酸質譜檢測方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201711450591.2
• 申請日: 2017-12-27
• 公開（公告）號: CN108070660A
• 公開（公告）日: 2018-05-25
• 發(fā)明（設計）人: 聶宵;林茂俊;張鵬;劉曉霞;白楊楊
• 申請（專利權）人: 沃森克里克（北京）生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12N15/11;G01N27/62
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 王玉松

1.一種ERCC2基因rs13181位點SNP核酸質譜檢測引物組，其特征在于，包括如下引物：

上游引物rs13181-F：5`-ACGTTGGATGTAAGACCTTCTAGCACCACC-3`；

下游引物rs13181-R：5`-ACGTTGGATGAGCAGCTAGAATCAGAGGAG-3`；

延伸引物rs13181-E：5`-CAATCTGCTCTATCCTCT-3`。

2.一種應用權利要求1所述引物組的ERCC2基因rs13181位點SNP核酸質譜檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1：用上游引物rs13181-F和下游引物rs13181-R進行第一輪PCR，對模板DNA進行擴增，得到含有所述rs13181位點的片段；

S2：對步驟S1得到的片段進行去磷酸化處理，得到脫磷酸片段；

S3：用延伸引物rs13181-E對所述脫磷酸片段進行單堿基延伸，對SNP堿基序列進行擴增，從而實現(xiàn)不同SNP的分型；

S4：對步驟S3得到的樣品進行脫鹽處理，用質譜儀進行檢測。

3.如權利要求2所述的ERCC2基因rs13181位點SNP核酸質譜檢測方法，其特征在于，步驟S1中，第一輪PCR的反應體系中包括如下組分：

模板DNA 2ng/μl、rs13181-F引物0.05μM、rs13181-R引物0.05μM、Mg2+4mM、1×PCRBuffer、dNTP 10μM以及Taq DNA聚合酶1U。

4.如權利要求3所述的ERCC2基因rs13181位點SNP核酸質譜檢測方法，其特征在于，步驟S1中，第一輪PCR的反應條件如下：

(1)預變性：95℃2min；

(2)擴增：95℃30s，56℃30s，72℃60s，共45個循環(huán)；

(3)延伸：72℃5min，4℃∞。

5.如權利要求2所述的ERCC2基因rs13181位點SNP核酸質譜檢測方法，其特征在于，步驟S2中，去磷酸化的反應體系在第一輪PCR擴增產(chǎn)物的基礎上還包括如下成分：

0.24×SAP Buffer以及SAP酶0.5U。

6.如權利要求5所述的ERCC2基因rs13181位點SNP核酸質譜檢測方法，其特征在于，步驟S2中，去磷酸化的反應條件如下：

(1)去磷酸化：37℃40min；

(2)SAP酶滅活：85℃5min，4℃∞。

7.如權利要求2所述的ERCC2基因rs13181位點SNP核酸質譜檢測方法，其特征在于，步驟S3中，單堿基延伸的反應體系在去磷酸化產(chǎn)物的基礎上還包括如下成分：

0.222×iPLEX GOLD Buffer、1×iPLEX Termination mix、iPLEX延伸引物混合物0.84～1.57μM以及1×iPLEX Enzyme。

8.如權利要求7所述的ERCC2基因rs13181位點SNP核酸質譜檢測方法，其特征在于，步驟S3中，單堿基延伸的反應條件如下：

(1)預變性：94℃30s；

(2)擴增內循環(huán)：94℃5s，52℃5s，共5個循環(huán)；

(3)擴增外循環(huán)：94℃5s，52℃5s，80℃5s，共40個循環(huán)；

(4)延伸：72℃4min，4℃∞。

9.如權利要求2所述的ERCC2基因rs13181位點SNP核酸質譜檢測方法，其特征在于，步驟S4包括如下步驟：

S4.1：在樹脂板上鋪好潔凈樹脂待用，每孔6mg樹脂，風干10～20分鐘；

S4.2：向樣本板的樣本空內加入待測樣品，每個樣本孔再加15～20μLddH2O，用封口膜密封，進行瞬時離心；

S4.3：打開覆蓋所述樣本孔的封口膜，將所述樣本板倒扣在所述樹脂板上固定，將固定好的樣本板和樹脂板整體翻轉，輕敲樹脂板，以使樹脂板中的樹脂完全落入樣本板上相應樣本孔，用封口膜密封，進行瞬時離心；

S4.4：將樣本樹脂混合物搖勻，在旋轉器上慢速旋轉15min后，在4000rpm條件下離心5min，離心后點樣上機、用質譜儀對樣品進行檢測。