[發(fā)明專利]一種牛支原體藥敏快速檢測試劑盒及其制備方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201711447992.2 | 申請日： | 2017-12-27 |
| 公開（公告）號： | CN108179172B | 公開（公告）日： | 2020-05-22 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 張亮;楊宏軍;朱曼玲;王基隆;解曉莉;程凱慧;苗自利;呂亞妮;張云飛;楊美;劉來興 | 申請（專利權(quán)）人： | 山東省農(nóng)業(yè)科學院奶牛研究中心 |
| 主分類號： | C12Q1/04 | 分類號： | C12Q1/04;C12R1/35 |
| 代理公司： | 濟南圣達知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37221 | 代理人： | 王志坤 |
| 地址： | 250100 山東省*** | 國省代碼： | 山東;37 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 種牛 支原體 快速 檢測 試劑盒 及其 制備 方法 | ||
本發(fā)明涉及體外診斷試劑及制備方法，具體涉及一種牛支原體藥敏快速檢測試劑盒及其制備方法。本發(fā)明提供了一種牛支原體藥敏快速檢測試劑盒，所述試劑盒包括牛支原體培養(yǎng)液、藥敏板和抗生素藥物。所述牛支原體培養(yǎng)液包括以下成分及含量：PPLO粉10～15g，短肽2～4g，莫諾苷100～500mg，酵母粉2～6g，葡萄糖1～3g，丙酮酸鈉1.5～4.5g，MEM培養(yǎng)基80～120mL，1％(w/v)酚紅溶液2mL，馬血清100～300mL，30萬單位青霉素和ddH2O 700～800mL。本發(fā)明培養(yǎng)液能快速促進牛支原體生長，20?24h內(nèi)即可完成檢測，且性能穩(wěn)定，特異性強。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及體外診斷試劑及制備方法，具體涉及一種牛支原體藥敏快速檢測試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)
牛支原體(mycoplasma bovis)是引起成母牛乳腺炎、犢牛肺炎和關(guān)節(jié)炎的重要病原之一，有較強的傳染性，并常與其他病原菌混合感染，嚴重威脅牛群健康，給養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。牛支原體在1961年首次于患有乳腺炎牛的牛乳中分離得到，我國自2008年首次報道了牛支原體肺炎之后，不斷有各地牛場發(fā)生犢牛支原體肺炎死亡和成母牛支原體乳腺炎的病例。該病發(fā)病率高，犢牛治療不當或造成死亡，常與其他細菌或病毒混合感染時臨床癥狀復雜多樣，故僅通過臨床癥狀和用藥情況，不能準確判斷是否發(fā)生支原體感染。另外，由于支原體沒有細胞壁，多數(shù)抗生素對牛支原體無治療效果，牧場長期不規(guī)范用藥也使得少數(shù)有效抗生素也存在耐藥菌株。即使確定為支原體感染，也不能盲目用藥，合理的藥敏試驗是指導臨床用藥的重要參考依據(jù)。然而，目前在牛支原體藥敏試驗方面，尚沒有國家標準或專利可以參考，還未有商品化試劑盒。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明主要目的是提供一種牛支原體藥敏快速檢測試劑盒，幫助疾控部門和牛場及時發(fā)現(xiàn)支原體感染，制定有效治療方案，提升病牛治愈率，減少經(jīng)濟損失。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：
第一個方面，本發(fā)明提供一種牛支原體藥敏快速檢測試劑盒，所述試劑盒包括牛支原體培養(yǎng)液、藥敏板和抗生素藥物。
第二個方面，本發(fā)明提供一種所述牛支原體藥敏快速檢測試劑盒的制備方法，包括下述步驟：
(1)牛支原體培養(yǎng)液的制備：將PPLO粉12g，短肽3g，莫諾苷300mg，酵母粉4g，葡萄糖2.5g，丙酮酸鈉3.5g，溶于750mL ddH2O中，加入MEM培養(yǎng)基100mL，1％(w/v)酚紅溶液2mL，116℃滅菌20min后，加入56℃滅活的馬血清150mL和30萬單位青霉素，調(diào)節(jié)PH值為7.6～7.8，分裝至15mL培養(yǎng)管，9mL/管。
(2)藥敏板的制備：
S1.將96孔板經(jīng)粗洗、精洗、40℃恒溫烤干備用；
S2.將紅霉素、氟苯尼考、諾氟沙星、卡那霉素、替米考星、泰拉霉素、加米霉素和四環(huán)素溶解到1-5mL緩沖液中，依次稀釋至128μg/mL～0.125μg/mL；
S3.用加樣器分別吸取各濃度藥物添加到相對應(yīng)的96孔板中，靜置30分鐘后，吸出棄去。
本發(fā)明優(yōu)化了牛支原體培養(yǎng)液的成分和用量。短肽α-氨基酸以肽鏈連接在一起而形成的化合物，也是蛋白質(zhì)水解的中間產(chǎn)物。支原體基因組小，自身合成能力較弱，本發(fā)明技術(shù)人員發(fā)現(xiàn)，在牛支原體培養(yǎng)液中加入肽鏈為Tyr-Leu-Tyr-Glu-Val-Ala的低聚短肽后，能快速促進牛支原體的生長。
莫諾苷(分子式：C17H26O11，CAS號：25406-64-8)從山茱萸干燥成熟果肉中提取得到，研究表明莫諾苷具有保護細胞免于H2O2誘導的細胞毒性和細胞凋亡的作用。本發(fā)明技術(shù)人員發(fā)現(xiàn)在一定濃度范圍內(nèi)莫諾苷能夠延長支原體穩(wěn)定期，減慢了支原體凋亡的速度。
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