[發(fā)明專利]一種單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的測序方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711447883.0
• 申請日: 2017-12-27
• 公開（公告）號: CN109971843B
• 公開（公告）日: 2022-11-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳興棟;朱嗣博;慶濤;金力
• 申請（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)泰州健康科學(xué)研究院
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 北京集佳知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 劉偉;趙青朵

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的測序方法。本發(fā)明使用了PAP/PGP在RNA鏈的尾部加入多聚A/G，使RNA穩(wěn)定性增加，同時產(chǎn)一條可以用于逆轉(zhuǎn)錄和cDNA合成的延伸鏈。本發(fā)明在下游進(jìn)行有效RNA富集時，采用標(biāo)記核糖體DNA探針的磁珠純化小片段PCR非特異性產(chǎn)物，使用半退火夾板雜交，去除5s，5.8s，18s和28s大小的cDNA形式存在的rRNA，并在測序時減少大量無效的Reads數(shù)。本發(fā)明可以對單個真核細(xì)胞進(jìn)行一站式non?coding RNA、microRNA和mRNA的總轉(zhuǎn)錄組測序并產(chǎn)生該轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)矩陣，擺脫了一個細(xì)胞只能進(jìn)行一種測序的應(yīng)用局限。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的測序方法，尤其針對單細(xì)胞總RNA或單細(xì)胞長鏈非編碼RNA的測序方法。

背景技術(shù)

測序是對基因的序列進(jìn)行判斷的一種方法。每個物種的基因控制生物性狀的表達(dá)，而測序是指對基因的序列進(jìn)行判斷。第一代DNA測序技術(shù)(又稱Sanger測序)在1975年，由Sanger等人開創(chuàng)，并在1977年完成第一個基因組序列(噬菌體X174)，全長5375個堿基。研究人員經(jīng)過30年的實踐并對技術(shù)及測序策略的不斷改進(jìn)(如使用了不同策略的作圖法、鳥槍法)，2001年完成的首個人類基因組圖譜就是以改進(jìn)了的Sanger法為其測序基礎(chǔ)。Sanger測序雖讀長較長、準(zhǔn)確性高，但其測序成本高通量低等缺點，使得denovo測序、轉(zhuǎn)錄組測序等應(yīng)用難以普及。經(jīng)過數(shù)據(jù)不斷的技術(shù)開發(fā)和改進(jìn)，以Roche公司的454技術(shù)、illumina公司的Solexa，Hiseq技術(shù)，ABI公司的Solid技術(shù)為標(biāo)記的第二代測序技術(shù)誕生。

第二代測序技術(shù)的核心思想是邊合成邊測序(Sequencing by Synthesis)，即通過捕捉新合成的末端的標(biāo)記來確定DNA的序列，現(xiàn)有的技術(shù)平臺主要包括Roche/454 FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer和Applied Biosystems SOLID system。當(dāng)前在二代測序領(lǐng)域(Next Generation Sequencing)，RNA測序因其可分析體內(nèi)轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)水平、基因融合和選擇性剪切等細(xì)胞生物學(xué)過程而廣受研究者使用。

傳統(tǒng)的RNAseq在進(jìn)行細(xì)胞研究時，通常需要數(shù)十萬到數(shù)百萬細(xì)胞當(dāng)量的RNA作為模板進(jìn)行測序(100ng-5ug)。另一方面，由于細(xì)胞普遍存在個體差異，而一群細(xì)胞的基因表達(dá)水平，并無法確定和鑒別每個細(xì)胞的自身轉(zhuǎn)錄的異質(zhì)性。

單細(xì)胞中的RNA含量較低，通常僅10～20pg，大約合10⁵～10⁶個RNA分子，建庫方法的技術(shù)難度也較傳統(tǒng)組織樣本的RNA建庫要大得多。

單細(xì)胞RNA-Seq(轉(zhuǎn)錄組測序)是通過對單個細(xì)胞的mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，使用高通量測序手段，對單細(xì)胞中mRNA進(jìn)行基因表達(dá)定量、功能富集、代謝通路等分析。它可以解決傳統(tǒng)RNA定量技術(shù)在早期胚胎發(fā)育、干細(xì)胞、癌癥、免疫等研究領(lǐng)域中存在的樣品量極低或細(xì)胞異質(zhì)性的問題，是在單細(xì)胞水平研究基因表達(dá)強有力的工具，極大地拓展了RNA-Seq的應(yīng)用范圍。