[發明專利]一種單細胞轉錄組的測序方法

有效

• 申請號: 201711447883.0
• 申請日: 2017-12-27
• 公開（公告）號: CN109971843B
• 公開（公告）日: 2022-11-11
• 發明（設計）人: 陳興棟;朱嗣博;慶濤;金力
• 申請（專利權）人: 復旦大學泰州健康科學研究院
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 劉偉;趙青朵

1.一種單細胞轉錄組的測序方法，包括以下步驟：

1)細胞系經酶解消化后獲得單細胞，裂解獲得RNA；

2)進行PolyA和PolyG聚合酶反應使得RNA鏈的尾部加入多聚A/G；

3)TSO逆轉錄和PCR前擴增；

4)利用標記核糖體DNA探針的磁珠純化小片段PCR非特異性產物；所述標記核糖體DNA探針分別為SEQ ID NO:1-4所示5sDNA、SEQ ID NO:5-8所示5.8sDNA、SEQ ID NO:9-14所示18sDNA、SEQ ID NO:15-21所示28sDNA；

5)Tn5隨機片段化反應，摻入分選標簽和擴大PCR，控制濃度、片段長度，pooling和上機測序；

所述擴大PCR的反應體系為：

反應程序為：72℃3分鐘，95℃30秒，12次循環：95℃10秒+55℃30秒+72℃30秒，72℃5分鐘，10℃終止反應。

2.根據權利要求1所述的測序方法，所述PolyA聚合酶反應具體為先將CLB與H₂O、DTT、MnCl₂、ATP混合37℃反應3min，然后加入Poly-A-Polymerase和0.5％BSA 37℃反應15min或30min，隨后與dNTPs混合物、oligo dT、ERCC spike-ins和H₂O混合72℃反應3分鐘。

3.根據權利要求1或2所述的測序方法，所述PolyG聚合酶反應具體為先將CLB與H₂O、DTT、MnCl₂、ATP混合37℃反應3min，然后加入Poly-G-Polymerase和0.5％BSA 37℃反應5min或15min，隨后與dNTPs混合物、oligo dC、ERCC spike-ins和H₂O混合72℃反應3分鐘。

4.根據權利要求1-2任意一項所述的測序方法，所述TSO逆轉錄的反應體系為

反應程序為：90分鐘42℃，10次循環：50℃2分鐘+42℃2分鐘，70℃15分鐘，4℃終止反應。

5.根據權利要求1-2任意一項所述的測序方法，所述PCR前擴增反應體系為：

反應程序為：98℃3分鐘，16次循環：98℃20秒+67℃5秒+72℃6分鐘，72℃5分鐘，4℃終止反應。

6.根據權利要求1-2任意一項所述的測序方法，所述測序深度為10Mreads/樣本，讀長50SE。