[發明專利]一種檢測結核分枝桿菌的試劑盒

在審

• 申請號: 201711447790.8
• 申請日: 2017-12-27
• 公開（公告）號: CN109971754A
• 公開（公告）日: 2019-07-05
• 發明（設計）人: 遲大利;吳大治;夏懿
• 申請（專利權）人: 上海星耀醫學科技發展有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/04;C12R1/32
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了結核分枝桿菌的基于LAMP技術的檢測試劑盒。LAMP引物根據結核分枝桿菌的特異保守序列設計，每組引物包含4條寡核苷酸。用于結核分枝桿菌檢測時，肉眼觀察呈白色沉淀；陽性反應加入SYBR Green后，在紫外燈下觀察熒光綠色顯著增強。實時濁度儀檢測結果顯示產物濁度隨反應時間延長而增加，經凝膠電泳檢測后呈梯型條帶。本發明為結核分枝桿菌檢測提供了一個新的技術平臺，適宜在基層單位、現場監測和床旁檢測中推廣應用。

技術領域

本發明屬于以等溫擴增為代表的分子生物學檢測方法在結核分枝桿菌檢測方面的應用，即結核分枝桿菌的環介導等溫擴增檢測方法和試劑盒。

背景技術

結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis），俗稱結核桿菌，是引起結核病的病原菌，可侵犯全身各器官，但以肺結核為最多見。該病全球流行，為重要的傳染病。據WHO報道，每年約有800萬新病例發生，至少有300萬人死于該病。

細菌培養和涂片檢查是應用最為廣泛的病原學診斷技術之一，其中痰液培養約占50%以上。痰液標本檢驗對于呼吸道疾病的診斷和鑒別具有重要的臨床意義。但，傳統習慣程序的痰液標本細菌學檢驗其臨床符合率并不高。除了痰標本采集不規范導致的不合格標本帶來的培養結果與病人感染不相符外，還因為微生物和人體的相關性本身就具有復雜性：源自細菌的致病與條件致病的辨證性，如致病菌可能為正常攜帶，而細菌在肺通氣功能異常病人的下呼吸道的可以發生單純定植或感染，要證明培養結果與感染的相關性是醫學微生物學所面臨的難題，這也使得一直以來在對于痰培養的標準化進展十分緩慢。

國內外對結核分枝桿菌的檢測試劑主要基于抗體檢測、核酸檢測和藥敏培養基檢測等。目前，核酸檢測已成為結核分枝桿菌檢測的主要方法：PCR-熒光探針法、環介導恒溫擴增法、熒光PCR熔解曲線法、PCR-反向點雜交法、DNA微陣列芯片法等。其中，環介導等溫擴增法具有檢測靈敏度高、結果判斷直觀，且不需要熒光定量PCR儀等價格昂貴的設備等優點，具有廣泛應用前景。

環介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是一種新型等溫核酸擴增技術，具有快速、簡便、經濟、靈敏等優點，目前已被廣泛應用于核酸快速檢測領域。LAMP的原理是針對靶基因上6個區域設計2對引物(FIP[F1c+F2]、BIP[B2+B1c]、F3、B3)，在鏈置換型DNA聚合酶的作用下，于等溫條件在短時間內(30~90min)進行核酸擴增。在反應過程中，當一個dNTP分子結合到DNA鏈上時會解離下一個焦磷酸根離子，后者與鎂離子結合形成大量副產物——焦磷酸鎂，反應結果無需電泳檢測，肉眼可見白色沉淀，加入熒光染料后可觀察到綠色熒光。與傳統PCR相比，LAMP具有操作簡便、靈敏度高、特異性強、結果判定簡單、成本低廉等特點。LAMP檢測靈敏度至少比普通PCR 高出2個數量級。此外，等溫擴增僅需一個水浴鍋或恒溫裝置，對設備的要求簡單，其操作過程耗時較短，可在1小時內完成。LAMP反應結果的檢測不需要像普通PCR進行凝膠電泳，只需通過肉眼觀察白色渾濁或者綠色熒光即可，是一種高效、簡便、快捷、高通量的檢測方法。

本發明開發了一種針對結核分枝桿菌的環介導等溫擴增試劑盒，可對痰液樣本中的結核分枝桿菌進行高效、簡便、有效的檢測。

發明內容

本發明的目的在于：提供一種用于結核分枝桿菌核酸檢測的方法；另一目的在于提供一種用于該方法的試劑盒。

1. 結核分枝桿菌的LAMP檢測專用引物

根據結核分枝桿菌基因組特異性保守序列，應用在線引物設計軟件Primer ExplorerV5，上傳靶序列后，即可初步得到多組引物序列。