[發(fā)明專利]一種臍帶組織塊凍存、復(fù)蘇以及制備間充質(zhì)干細(xì)胞的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711447536.8
• 申請(qǐng)日: 2018-04-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108251361A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-07-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王健;王仁杰;熊華強(qiáng);秦連榮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 重慶斯德姆生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/0775
• 分類號(hào): C12N5/0775;A01N1/02;C40B50/06
• 代理公司: 重慶百潤(rùn)洪知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 50219
• 代理人: 劉立春

本發(fā)明涉及一種臍帶組織塊凍存、復(fù)蘇以及制備間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其包括如下步驟：對(duì)臍帶組織進(jìn)行消毒和清洗；將組織剪成組織段；剝離華通膠，將華通膠剪成塊狀；向塊狀組織中加入凍存液，先后在4℃下冷藏0.5小時(shí)，?20℃冷藏2小時(shí)，?80℃下冷凍1天，最后液氮中冷凍備用；需要時(shí)將塊狀組織從液氮中取出，恒溫水浴解凍，利用無(wú)血清培養(yǎng)基清洗組織后，直接接種至明膠鋪被的培養(yǎng)皿中制備間充質(zhì)干細(xì)胞。本發(fā)明方法可有效保護(hù)凍存臍帶組織，且方便復(fù)蘇使用，尤其適合復(fù)蘇后分離和擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種臍帶組織塊凍存、復(fù)蘇以及制備間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一種能夠進(jìn)行自我更新、多分化潛能的多能干細(xì)胞，可以向神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肌細(xì)胞等多種終末組織器官的細(xì)胞分化，其在細(xì)胞替代治療、支持造血、基因治療等方面有著廣泛的應(yīng)用前景。

臍帶是連接胎兒和胎盤的管狀結(jié)構(gòu)，有兩條動(dòng)脈和一條靜脈。研究顯示，在臍帶血管和內(nèi)壁之間含有疏松的膠狀物質(zhì)(稱為華通膠)，該膠狀物質(zhì)里含有豐富的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。從臍帶分離出來(lái)的干細(xì)胞更原始，有更強(qiáng)的增殖分化能力。其免疫細(xì)胞的功能活性低，大大降低了觸發(fā)免疫反應(yīng)及引起移植物抗宿主病的風(fēng)險(xiǎn)。潛伏性病毒和微生物的感染及傳播幾率比較低。采集過(guò)程簡(jiǎn)單，對(duì)產(chǎn)婦及新生兒無(wú)任何危害及損傷。以上原因使得臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成為研究的熱點(diǎn)。

但是，臍帶組織分離干細(xì)胞的方法和技術(shù)還不是完全成熟，而且每一份臍帶組織的處理和干細(xì)胞制備培養(yǎng)都需要一定的時(shí)間和人員的消耗。因此將臍帶組織凍存并且在有需要的時(shí)候復(fù)蘇進(jìn)行干細(xì)胞制備的做法相對(duì)更符合成本效益。并且在制備MSCs時(shí)使用含血清培養(yǎng)基，雖然可以在較短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增MSCs，但動(dòng)物血清所帶來(lái)的異源性污染可為臨床MSCs的應(yīng)用帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)。因此，無(wú)血清培養(yǎng)基越來(lái)越受到關(guān)注。相比起來(lái)，無(wú)血清培養(yǎng)基成分確定，批次穩(wěn)定，更容易實(shí)現(xiàn)細(xì)胞應(yīng)用中的安全性和可控性。但目前無(wú)血清培養(yǎng)基存在的普遍問(wèn)題在于對(duì)原代細(xì)胞的貼壁和生長(zhǎng)支持能力不足。

因此，本領(lǐng)域需要一個(gè)簡(jiǎn)單、高效、無(wú)污染的臍帶組織凍存、復(fù)蘇以及制備間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，以滿足醫(yī)藥、科研、臨床等領(lǐng)域的需求。

發(fā)明內(nèi)容

為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種臍帶組織塊凍存、復(fù)蘇以及制備間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。

本發(fā)明第一方面提出一種臍帶組織塊凍存、復(fù)蘇以及制備間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其包括以下步驟：

(1)用消毒液對(duì)臍帶組織表面進(jìn)行消毒，將臍帶剪開(kāi)，平鋪，用緩沖液清洗臍帶組織；

(2)將步驟(1)獲得的臍帶組織剪成組織段；

(3)剝離所述組織段的華通膠，將華通膠置于潔凈的離心管內(nèi)，用手術(shù)剪剪成塊狀；

(4)向所述塊狀組織中加入無(wú)血清培養(yǎng)基，無(wú)血清培養(yǎng)基的體積為所述塊狀組織體積的二分之一，重懸塊狀組織后加入與無(wú)血清培養(yǎng)基等體積的預(yù)冷凍存液，分裝至凍存管中；

(5)將步驟(4)獲得的含有塊狀組織的凍存管先后在4℃下冷藏0.5小時(shí)，-20℃冷藏2小時(shí)，-80℃下冷凍1天，最后在-196℃液氮中冷凍備用；

(6)需要時(shí)將步驟(5)冷凍的塊狀組織從液氮中取出，在恒溫水浴中解凍，用移液管吸取解凍的組織塊，放入潔凈的離心管中，加入無(wú)血清培養(yǎng)基混勻，然后于低溫離心，去掉上清液；

(7)將步驟(6)離心后的塊狀組織接種至明膠鋪被的培養(yǎng)皿中，加入無(wú)血清培養(yǎng)基后放入CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；以及

(8)培養(yǎng)后的3～5天進(jìn)行第一次換液，以后4～5天換一次液。待細(xì)胞融合度達(dá)到70％以上后，使用胰蛋白酶進(jìn)行消化后傳代，即獲得臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。