[發明專利]一種臍帶組織塊凍存、復蘇以及制備間充質干細胞的方法

在審

• 申請號: 201711447536.8
• 申請日: 2018-04-19
• 公開（公告）號: CN108251361A
• 公開（公告）日: 2018-07-06
• 發明（設計）人: 王健;王仁杰;熊華強;秦連榮
• 申請（專利權）人: 重慶斯德姆生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;A01N1/02;C40B50/06
• 代理公司: 重慶百潤洪知識產權代理有限公司 50219
• 代理人: 劉立春

1.一種臍帶組織塊凍存、復蘇以及制備間充質干細胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

(1)用消毒液對臍帶組織表面進行消毒，將臍帶剪開，平鋪，用緩沖液清洗臍帶組織；

(2)將步驟(1)獲得的臍帶組織剪成組織段；

(3)剝離所述組織段的華通膠，將華通膠置于潔凈的離心管內，用手術剪剪成塊狀；

(4)向所述塊狀組織中加入無血清培養基，無血清培養基的體積為所述塊狀組織體積的二分之一，重懸塊狀組織后加入與無血清培養基等體積的預冷凍存液，分裝至凍存管中；

(5)將步驟(4)獲得的含有塊狀組織的凍存管先后在4℃下冷藏0.5小時，-20℃冷藏2小時，-80℃下冷凍1天，最后在-196℃液氮中冷凍備用；

(6)需要時將步驟(5)冷凍的塊狀組織從液氮中取出，在恒溫水浴中解凍，用移液管吸取解凍的組織塊，放入潔凈的離心管中，加入無血清培養基混勻，然后于低溫離心，去掉上清液；

(7)將步驟(6)離心后的塊狀組織接種至明膠鋪被的培養皿中，加入無血清培養基后放入CO₂培養箱內培養；以及

(8)培養后的3～5天進行第一次換液，以后4～5天換一次液，待細胞融合度達到70％以上后，使用胰蛋白酶進行消化后傳代，即獲得臍帶間充質干細胞。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述消毒液為體積百分濃度75％的酒精；所述緩沖液為含有氨基青霉素和硫酸鏈霉素的PBS緩沖液。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述組織段的長度2～4cm；所述塊狀的表面積為1～2mm³。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述預冷凍存液包含二甲基亞砜。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，以體積計，所述無血清培養基包括以下成分：

α-MEM10.3g/L、碳酸氫鈉2.3g/L、碳酸鈉1.8g/L、磷酸一氫鈉2.0g/L、磷酸二氫鈉1.7g/L、L-谷氨酰胺2-8mM、重組人白蛋白2-6g/L、重組人轉鐵蛋白10-15mg/L、重組人胰島素5-10mg/L、β-巰基乙醇50nM、谷胱甘肽0.1-3mg/L、對氨基苯甲酸0.5-5mg/L、維生素B 25-40mg/L、維生素C 20-50mg/L、黃體酮10-20ng/mL、腐胺5-10mg/L、肝素5-10IU/mL、EGF5-10ng/mL、b-FGF 6-10ng/mL、HGF 6-10ng/mL、VEGF 6-10ng/mL、脂質0.1-1mg/L、微量元素1-8mg/L以及式I化合物6-12μM。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述式I化合物的結構式如下：

7.根據權利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述脂質包括膽固醇、花生四烯酸、原兒茶酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸中的一種或多種的組合。

8.根據權利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述微量元素包括Mg、Cu、Zn、Se、Fe、Sn、Ge、Rb、Co和Mn中的任意一種或多種的組合。

9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，進一步包括步驟：

(9)針對步驟(8)所得臍帶間充質干細胞，檢測以下項目的至少一項：細胞活性、細胞污染、遺傳病、HLA-ABC/DR配型；或

(10)將步驟(8)所得傳代后的臍帶間充質干細胞于液氮中凍存，備用。

10.一種建立臍帶干細胞數據庫的方法，其特征在于，所述方法包括權利要求1-9任一項所述方法的步驟，以及以下步驟：將傳代后的細胞于液氮中凍存并記錄相關胎兒信息，并進行細胞的生物學特性及多向分化潛能鑒定，以及對細胞進行分子遺傳學診斷，保存細胞的所有相關數據，建立臍帶干細胞的數據庫并與凍存細胞進行關聯。