[發(fā)明專利]一種TERT基因rs10069690位點(diǎn)SNP核酸質(zhì)譜檢測(cè)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711446671.0
• 申請(qǐng)日: 2017-12-27
• 公開（公告）號(hào): CN108060229A
• 公開（公告）日: 2018-05-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 聶宵;林茂俊;張鵬;劉曉霞;白楊楊
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 沃森克里克（北京）生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6886
• 分類號(hào): C12Q1/6886;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 王玉松

1.一種TERT基因的rs10069690位點(diǎn)SNP核酸質(zhì)譜檢測(cè)引物組，其特征在于，包括如下引物：

上游引物rs10069690-F：5`-ACGTTGGATGTCAGTTGCCTGGGCTTATTG-3`；

下游引物rs10069690-R：5`-ACGTTGGATGCTGAGCACTACCCATGATAG-3`；

延伸引物rs10069690-E：5`-GGAAGGGAGATTTTGACAG-3`。

2.一種應(yīng)用權(quán)利要求1所述引物組的TERT基因rs10069690位點(diǎn)SNP核酸質(zhì)譜檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1：用上游引物rs10069690-F和下游引物rs10069690-R進(jìn)行第一輪PCR，對(duì)模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增，得到含有所述rs10069690位點(diǎn)的片段；

S2：對(duì)步驟S1得到的片段進(jìn)行去磷酸化處理，得到脫磷酸片段；

S3：用延伸引物rs10069690-E對(duì)所述脫磷酸片段進(jìn)行單堿基延伸，對(duì)SNP堿基序列進(jìn)行擴(kuò)增，從而實(shí)現(xiàn)不同SNP的分型；

S4：對(duì)步驟S3得到的樣品進(jìn)行脫鹽處理，用質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)。

3.如權(quán)利要求2所述的TERT基因rs10069690位點(diǎn)SNP核酸質(zhì)譜檢測(cè)方法，其特征在于，步驟S1中，第一輪PCR的反應(yīng)體系中包括如下組分：

模板DNA 2ng/μl、rs10069690-F引物0.05μM、rs10069690-R引物0.05μM、Mg2+4mM、1×PCR Buffer、dNTP 10μM以及Taq DNA聚合酶1U。

4.如權(quán)利要求3所述的TERT基因rs10069690位點(diǎn)SNP核酸質(zhì)譜檢測(cè)方法，其特征在于，步驟S1中，第一輪PCR的反應(yīng)條件如下：

(1)預(yù)變性：95℃ 2min；

(2)擴(kuò)增：95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 60s，共45個(gè)循環(huán)；

(3)延伸：72℃ 5min，4℃ ∞。

5.如權(quán)利要求2所述的TERT基因rs10069690位點(diǎn)SNP核酸質(zhì)譜檢測(cè)方法，其特征在于，步驟S2中，去磷酸化的反應(yīng)體系在第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的基礎(chǔ)上還包括如下成分：

0.24×SAP Buffer以及SAP酶0.5U。

6.如權(quán)利要求5所述的TERT基因rs10069690位點(diǎn)SNP核酸質(zhì)譜檢測(cè)方法，其特征在于，步驟S2中，去磷酸化的反應(yīng)條件如下：

(1)去磷酸化：37℃ 40min；

(2)SAP酶滅活：85℃ 5min，4℃ ∞。

7.如權(quán)利要求2所述的TERT基因rs10069690位點(diǎn)SNP核酸質(zhì)譜檢測(cè)方法，其特征在于，步驟S3中，單堿基延伸的反應(yīng)體系在去磷酸化產(chǎn)物的基礎(chǔ)上還包括如下成分：

0.222×iPLEX GOLD Buffer、1×iPLEX Termination mix、iPLEX延伸引物混合物0.84～1.57μM以及1×iPLEX Enzyme。

8.如權(quán)利要求7所述的TERT基因rs10069690位點(diǎn)SNP核酸質(zhì)譜檢測(cè)方法，其特征在于，步驟S3中，單堿基延伸的反應(yīng)條件如下：

(1)預(yù)變性：94℃ 30s；

(2)擴(kuò)增內(nèi)循環(huán)：94℃ 5s，52℃ 5s，共5個(gè)循環(huán)；

(3)擴(kuò)增外循環(huán)：94℃ 5s，52℃ 5s，80℃ 5s，共40個(gè)循環(huán)；

(4)延伸：72℃ 4min，4℃ ∞。

9.如權(quán)利要求2所述的TERT基因的rs10069690位點(diǎn)SNP核酸質(zhì)譜檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟S4包括如下步驟：

S4.1：在樹脂板上鋪好潔凈樹脂待用，每孔6mg樹脂，風(fēng)干10～20分鐘；

S4.2：向樣本板的樣本空內(nèi)加入待測(cè)樣品，每個(gè)樣本孔再加15～20μL ddH2O，用封口膜密封，進(jìn)行瞬時(shí)離心；

S4.3：打開覆蓋所述樣本孔的封口膜，將所述樣本板倒扣在所述樹脂板上固定，將固定好的樣本板和樹脂板整體翻轉(zhuǎn)，輕敲樹脂板，以使樹脂板中的樹脂完全落入樣本板上相應(yīng)樣本孔，用封口膜密封，進(jìn)行瞬時(shí)離心；

S4.4：將樣本樹脂混合物搖勻，在旋轉(zhuǎn)器上慢速旋轉(zhuǎn)15min后，在4000rpm條件下離心5min，離心后點(diǎn)樣上機(jī)、用質(zhì)譜儀對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。