[發明專利]一種優化的生物膜活菌計數法

有效

• 申請號: 201711446418.5
• 申請日: 2017-12-27
• 公開（公告）號: CN108165604B
• 公開（公告）日: 2020-09-11
• 發明（設計）人: 李淑鈺;江丹;鐘美;邱振名;黃亮;張利萍
• 申請（專利權）人: 廣州立白企業集團有限公司
• 主分類號: C12Q1/06
• 分類號: C12Q1/06;C12N1/20;C12R1/46;C12R1/04;C12R1/225;C12R1/01
• 代理公司: 深圳市精英專利事務所 44242
• 代理人: 王文伶

本發明涉及口腔護理產品抗菌功效評價技術領域，具體為一種優化的生物膜活菌計數法。本發明提供的優化的生物膜活菌計數法，先通過胰酶溶液對牙菌斑生物膜模型進行消化分散，同時再對形成生物膜菌懸液進行超聲分散，然后采用活菌計數法計算細菌數目，細菌團分散效果明顯，可提高活菌計數結果，更加接近真實的生物膜上活體細菌的數目。此外，通過優化牙菌斑生物膜模型的培養條件，在特定的培養條件下培養形成可靠的且可提高對口腔護理產品抗菌功效評價準確度的牙菌斑生物膜模型，尤其是通過加入一定含量的碳酸鈣懸濁液作為附著力促進劑，可保證本發明的計數方法對后續口腔護理產品評價準確度的情況下有效縮短牙菌斑生物膜模型的培養時間。

技術領域

本發明涉及活菌計數技術領域，具體涉及一種優化的生物膜活菌計數法。

背景技術

口腔里生存著多種多樣的微生物，包括細菌、真菌、病毒、支原體、原蟲等，其存在形式包括游離態和聚集態，游離態的微生物稱為浮游微生物，聚集態的微生物主要以牙菌斑生物膜的形式存在于人的口腔。與游離態相比，以生物膜形式存在的微生物群具有以下特點：

(1)微生物之間相互積聚和定殖，具有空間和環境的多樣性；

(2)活性強，能夠抵御苛刻的環境而存活；

(3)耐受性強，對抗菌劑敏感性下降；

(4)能表達不同于浮游細菌的表型。

牙菌斑生物膜中微生物的生存能力、抗藥性、代謝效率均顯著高于浮游微生物；兩者呈現完全不同的生理特征。

口腔里眾多的微生物彼此之間處于一種平衡狀態，一旦這種平衡被打破，就將導致齲齒，牙齦炎，牙周炎和口源性口臭病等口腔多微生物疾病的發生。牙菌斑是一種經典的生物膜，是粘附在牙齒表面或口腔其他軟組織上的微生物群，這些微生物大多為兼性厭氧菌或者嚴格厭氧菌，其代謝活性強，比菌斑生物膜外的微生物更難被殺滅或祛除，從而大大增加了齲病和牙周病等口腔疾病發生的幾率。因此是否能夠有效預防和抑制牙菌斑成為了評價口腔護理產品的一個重要指標之一。

長期以來，牙膏、漱口水等口腔護理產品的抗菌功效體外檢測主要是通過對游離菌的抗菌功效來評價。目前的體外檢測方法主要采用菌懸液抗菌測試法、微量肉湯稀釋法檢測最小抑菌濃度MIC等試驗來檢驗口腔護理產品對口腔游離細菌的抗菌作用。顯然，口腔護理產品對于游離菌的抗菌效能和對生物膜的抗菌效能不能等同視之。例如，口腔護理產品對游離菌的效果是以懸液法測定產品的抑菌率(Inhibition Rate,IR)來評價，大部分樣品的結果為＞99.9％。口腔中大多數的致病菌是存在于牙菌斑生物膜中，導致生物膜中的微生物遠比游離菌難被殺滅，口腔護理產品中的抗菌劑必須滲透到生物膜內部才能發揮作用。因此，針對游離菌的懸液法抗菌測試難以反映口腔護理產品對于口腔內微生物真實的殺滅/抑制效果。

綜上所述，游離菌的抗菌測試方法(或稱游離菌法)不能獲得真實情況下口腔產品抗菌效能評價數據，難以指引相關產品的開發和優化。為了獲得更加接近真實情況的結果，牙膏、漱口水等口腔護理產品對生物膜的抗菌功效的評價目前主要是通過臨床試驗來完成。臨床試驗是一種較為真實和客觀地評價產品對生物膜抗菌效能的方法，其結果相對可靠又有代表性，但也存在一些明顯的缺點：(1)耗時長，約需1周；(2)費用高；(3)受測個體差異性大；(4)需要受測個體的高度配合。口腔護理產品的前期配方研究需要對大量不同濃度的抗菌原料進行篩選，臨床試驗不利于口腔護理產品的前期大量配方的篩選工作。此外，能否準確地測試計算生物膜中活體細菌的數量也直接影響著后續對口腔護理產品抗菌功效的評價準確性，因此改善和優化計算生物膜中活體細菌的方法對評價口腔護理產品的抗菌功效也至關重要。

綜上所述，建立一種快速、重復性強、結果可信的抗菌功效測試與評價方法，對于口腔護理產品的開發和配方篩選是非常必要的。

發明內容

本發明針對上述問題，提供一種可靠的且可提高對口腔護理產品抗菌功效評價準確度的優化的生物膜活菌計數法。