[發明專利]一種優化的生物膜活菌計數法

有效

• 申請號: 201711446418.5
• 申請日: 2017-12-27
• 公開（公告）號: CN108165604B
• 公開（公告）日: 2020-09-11
• 發明（設計）人: 李淑鈺;江丹;鐘美;邱振名;黃亮;張利萍
• 申請（專利權）人: 廣州立白企業集團有限公司
• 主分類號: C12Q1/06
• 分類號: C12Q1/06;C12N1/20;C12R1/46;C12R1/04;C12R1/225;C12R1/01
• 代理公司: 深圳市精英專利事務所 44242
• 代理人: 王文伶

1.一種優化的生物膜活菌計數法，其特征在于，所述生物膜為體外的牙菌斑生物膜模型：

所述牙菌斑生物膜模型由以下步驟培養形成：

S01、在無氧氣氛及恒溫的環境中，分別對各種口腔致病菌在TSA補加培養基平板上劃線培養2～6天至平板上出現大量菌苔；

S02、將經步驟S01培養后的各種口腔致病菌分別接種到BHI富集培養基，在無氧氣氛及恒溫的環境中分別培養1～3天至BHI富集培養基渾濁，得到各種口腔致病菌的成熟菌懸液；

S03、將步驟S02所得的各種成熟菌懸液添加到含附著力促進劑的BHI富集培養基中，每一種成熟菌懸液的體積百分比為2％～8％；然后在無氧氣氛及恒溫的環境中接種到成膜介質的孔中，培養14～18小時，在成膜介質的孔壁上形成孔型的牙菌斑生物膜模型；

所述TSA補加培養基是指每升TSA培養基中含有5克酵母提取物、0.5克L-半胱氨酸鹽酸鹽、5毫克氯化血紅素和1毫克維生素K1的培養基；

所述BHI富集培養基是指每升BHI培養基中含有1克蔗糖、1克葡萄糖、1克D-甘露糖、0.5克L-半胱氨酸鹽酸鹽、5毫克氯化血紅素和1毫克維生素K1的培養基；

所述附著力促進劑為碳酸鈣懸濁液，含附著力促進劑的BHI富集培養基中碳酸鈣的質量百分比為0.2％；

所述生物膜活菌計數法，包括以下步驟：

S1消化分散：向生物膜中加入胰酶溶液并在常溫下進行消化處理，然后再向生物膜中加入培養基，所述牙菌斑生物膜模型使用24孔細胞培養板培養形成時，向牙菌斑生物膜模型的孔中加入100～200μL質量百分比為0.25％的胰酶溶液，常溫消化5min后再沿孔壁向孔中加入BHI富集培養 基至總體積為1mL，接著將生物膜吹打混勻重懸形成生物膜菌懸液；

S12超聲分散：將步驟S1所得的生物膜菌懸液裝入無菌離心管中，然后將裝有生物膜菌懸液的離心管置于超聲波清洗儀中進行超聲；超聲分散是生物膜菌懸液在25℃下超聲6min；

S2計數：用活菌計數法測定生物膜菌懸液的細菌數目，即為生物膜中的活菌數目。

2.根據權利要求1所述一種優化的生物膜活菌計數法，其特征在于，所述口腔致病菌包含血鏈球菌、變異鏈球菌、粘性放線菌、鼠李糖乳桿菌、牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌。

3.根據權利要求1所述一種優化的生物膜活菌計數法，其特征在于，所述無氧氣氛是指由體積比為80％氮氣、10％氫氣和10％二氧化碳構成的氣體環境。

4.根據權利要求1所述一種牙菌斑生物膜模型的培養方法，其特征在于，所述恒溫的溫度為36℃。