[發明專利]一種重組豬α-干擾素、其制備方法及其應用在審
| 申請號： | 201711444512.7 | 申請日： | 2017-12-27 |
| 公開（公告）號： | CN108179151A | 公開（公告）日： | 2018-06-19 |
| 發明（設計）人： | 王雷;凌紅麗;魏波;曲信芹;劉曉婧;孫亞磊;蔣貽海;王艷玲;王宏華;于春梅;蔣皓靜;武利利 | 申請（專利權）人： | 青島蔚藍生物股份有限公司;青島動保國家工程技術研究中心有限公司 |
| 主分類號： | C12N15/70 | 分類號： | C12N15/70;C12N15/21;C12N1/21;C07K14/56;A61K38/21;A61P31/12;A61P35/00;A61P37/04;C12R1/19 |
| 代理公司： | 青島清泰聯信知識產權代理有限公司 37256 | 代理人： | 李祺;高洋 |
| 地址： | 266000 山東省青島市嶗山*** | 國省代碼： | 山東;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 重組豬α -干擾素 干擾素 制備 畜禽病毒性傳染病 高抗病毒活性 基因工程領域 治療畜禽病毒 大腸桿菌 干擾素基因 干擾素效價 抗病毒活性 變性純化 有效應用 誘導表達 包涵體 內切酶 性疾病 復性 位點 應用 優化 克隆 預防 轉化 | ||
1.一種重組豬α-干擾素的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
選擇GenBank登錄號為28623的豬α-干擾素基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
翻譯SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，翻譯后的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
將SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列按照大腸桿菌密碼子進行優化，消除常規限制性內切酶酶切位點，并對其RNA二級結構進行優化，優化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
在SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列兩端分別加入NdeI和EcoRI位點并克隆到pGEM-Teasy載體中，挑取陽性克隆后進行測序鑒定，得到質粒pGEM-pigIFNa1；
利用NdeI和EcoRI限制性內切酶將質粒pGEM-pigIFNa1中的豬干擾素pigIFNa1切下，瓊脂糖凝膠電泳回收523bp片段，克隆到預先以NdeI和EcoRI限制性內切酶酶切的氨芐青霉素抗性載體中，挑取陽性克隆進行測序鑒定，得到重組質粒pET23-pigIFNa1；
將重組質粒pET23-pigIFNa1轉化感受態大腸桿菌BL21，經IPTG誘導表達，收集表達菌體，經超聲破碎后，得到包涵體，將所得包涵體洗滌、變性、復性，再經親和層析純化，得到重組豬α-干擾素。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，在得到優化后的如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列之后，還包括將SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列與SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列比對的步驟，以及將SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列翻譯為如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，并將其與SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列比對的步驟。
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，其中，SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列與SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列比對結果一致。
4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，洗滌步驟包括：將包涵體依次經1％Triton X-100及2M尿素重懸洗滌；變性步驟包括：將1g純化的包涵體在40ml 7M鹽酸胍溶液中完全變性，變性液中蛋白含量為8～10mg/ml；復性步驟包括：將變性蛋白溶液逐滴緩慢加入胱氨酸-半胱氨酸復性液中，使蛋白含量約為0.1mg/ml，4℃靜置復性24-40小時。
5.一種如權利要求1-4任一項所述的制備方法制備得到的重組豬α-干擾素，其特征在于，采用MDBK-VSV系統檢測其活性不低于1010U/mg。
6.一種含有如權利要求5所述的重組豬α-干擾素的藥物。
7.根據權利要求6所述的藥物，其特征在于，所述藥物為抗病毒、抗細胞增殖和增強免疫功能的藥物。
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