[發明專利]一種重組豬α-干擾素、其制備方法及其應用

在審

• 申請號: 201711444512.7
• 申請日: 2017-12-27
• 公開（公告）號: CN108179151A
• 公開（公告）日: 2018-06-19
• 發明（設計）人: 王雷;凌紅麗;魏波;曲信芹;劉曉婧;孫亞磊;蔣貽海;王艷玲;王宏華;于春梅;蔣皓靜;武利利
• 申請（專利權）人: 青島蔚藍生物股份有限公司;青島動保國家工程技術研究中心有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/21;C12N1/21;C07K14/56;A61K38/21;A61P31/12;A61P35/00;A61P37/04;C12R1/19
• 代理公司: 青島清泰聯信知識產權代理有限公司 37256
• 代理人: 李祺;高洋

本發明提出一種重組豬α?干擾素、其制備方法及其應用，屬于基因工程領域，該重組豬α?干擾素具有高抗病毒活性，可有效應用于畜禽病毒性傳染病防控方面。該技術方案包括通過對豬α?干擾素基因優化、RNA二級結構優化及某些常見內切酶位點消除后克隆至pET?23b(+)載體上轉化大腸桿菌進行誘導表達，經包涵體分離變性純化復性后，獲得重組豬α?干擾素。本發明提供的重組豬α?干擾素效價很高，抗病毒活性可達10¹⁰U/mg，能夠有效應用在預防和治療畜禽病毒性疾病方面。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，尤其涉及一種重組豬α-干擾素、其制備方法及其應用。

背景技術

近來，病毒性傳染病日益泛濫，已嚴重威脅我國畜牧業的持續發展。免疫抑制病及病毒抗原快速變異，常導致疫苗免疫失敗，加之不斷出現新的病毒病，目前還尚無成功的疫苗接種預防。另一方面，疫苗對疾病只有預防作用，治療還有賴于抗生素的使用。而一些抗藥性菌株的出現，給人類食品和健康帶來極大的威脅，一些國家已命令禁止在養殖生產中應用某些抗生素和抗菌劑。因此，生產中迫切需要一種既有效又有利于環保的新方法來防控畜禽疾病。實踐證明，干擾素作用一種廣譜的抗病毒劑，在病毒性傳染病的防控方面具有廣闊的應用前景。

豬α-干擾素是動物在特定誘導劑如某種病毒作用下產生的一類具有廣譜高效抗病毒作用的細胞因子，其作用機理是誘導宿主細胞產生抗病毒蛋白，從而減少病毒增殖。豬α-干擾素對豬的傳染性胃腸炎、流行性腹瀉、藍耳病等均有一定療效，但其在抑制病毒試驗中使用α-干擾素時并沒有發現在同樣較高濃度使用其它動物型干擾素時所表現出的細胞毒性。因此，如何提供一種具有高活性的豬α-干擾素將是本領域目前需要研究的課題。

發明內容

本發明提出一種重組豬α-干擾素、其制備方法及其應用，該重組豬α-干擾素具有高抗病毒活性，可有效應用于畜禽病毒性傳染病防控方面。

為了達到上述目的，本發明的一方面提供了一種重組豬α-干擾素的制備方法，包括以下步驟：

選擇GenBank登錄號為28623的豬α-干擾素基因序列，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；

翻譯SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，翻譯后的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

將SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列按照大腸桿菌密碼子進行優化，消除常規限制性內切酶酶切位點，并對其RNA二級結構進行優化，優化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

在SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列兩端分別加入NdeI和EcoRI位點并克隆到pGEM-T easy載體中，挑取陽性克隆后進行測序鑒定，得到質粒pGEM-pigIFNa1；

利用NdeI和EcoRI限制性內切酶將質粒pGEM-pigIFNa1中的豬干擾素pigIFNa1切下，瓊脂糖凝膠電泳回收523bp片段，克隆到預先以NdeI和EcoRI限制性內切酶酶切的氨芐青霉素抗性載體中，挑取陽性克隆進行測序鑒定，得到重組質粒pET23-pigIFNa1；

將重組質粒pET23-pigIFNa1轉化感受態大腸桿菌BL21，經IPTG誘導表達，收集表達菌體，經超聲破碎后，得到包涵體，將所得包涵體洗滌、變性、復性，再經親和層析純化，得到重組豬α-干擾素。

作為優選，在得到優化后的如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列之后，還包括將SEQID NO.3所示的核苷酸序列與SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列比對的步驟，以及將SEQ IDNO.3所示的核苷酸序列翻譯為如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，并將其與SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列比對的步驟。

作為優選，其中，SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列與SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列比對結果一致。