[發(fā)明專利]一種高效表達P53抑癌蛋白的T細胞、制備方法及應用在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201711434089.2 | 申請日： | 2017-12-26 |
| 公開（公告）號： | CN108060135A | 公開（公告）日： | 2018-05-22 |
| 發(fā)明（設計）人： | 王泰華;王欣;張剛;崔曉慧 | 申請（專利權(quán)）人： | 東莞賽爾生物科技有限公司 |
| 主分類號： | C12N5/10 | 分類號： | C12N5/10;C12N15/66;C12N15/85;A61K35/17;A61P35/00 |
| 代理公司： | 濟南誠智商標專利事務所有限公司 37105 | 代理人： | 朱彩霞 |
| 地址： | 523808 廣東省*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 高效 表達 p53 蛋白 細胞 制備 方法 應用 | ||
1.一種高效表達P53抑癌蛋白的T細胞，其特征是，由p53真核表達載體轉(zhuǎn)染T細胞得到；
所述p53真核表達載體，是將p53基因連接至pcDNA 3.1載體中構(gòu)建而成。
2.權(quán)利要求1所述的高效表達P53抑癌蛋白的T細胞的制備方法，其特征是，步驟為：
(1)構(gòu)建穩(wěn)定表達p53真核表達載體：將p53基因與pcDNA 3.1載體連接，構(gòu)建p53真核表達載體pcDNA 3.1-p53；
(2)轉(zhuǎn)染免疫T細胞：將新鮮的T細胞加入含有10％FBS的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，用抗CD3、CD28抗體、IL-2刺激T細胞，第三天用lipofectamine 2000將構(gòu)建好的pcDNA 3.1-p53載體轉(zhuǎn)染T細胞，篩選得到穩(wěn)定過表達p53的T細胞株p53-T細胞。
3.如權(quán)利要求2所述的高效表達P53抑癌蛋白的T細胞的制備方法，其特征是，所述步驟(1)構(gòu)建穩(wěn)定表達p53真核表達載體，具體步驟是：
1-1目的基因獲取
合成的BamH I-p53-BamH I基因通過BamH I酶切后回收純化p53基因片段，備用；
1-2目的基因與載體連接
pcDNA 3.1(+)空載體經(jīng)BamH I酶切回收后去磷酸化處理；將回收的p53片段與酶切過的pcDNA3.1(+)空載連接，16℃水浴過夜；
1-3連接載體轉(zhuǎn)化
將16μL上述連接產(chǎn)物全部加入100μL大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，冰浴30min，立即在42℃水浴中熱擊90s后移至冰上冰浴2min；加入400μL LB培養(yǎng)基，37℃，200rpm培養(yǎng)1h；滴加10μL菌液至含有100μg·mL
1-4陽性菌落篩選
挑選大腸桿菌單克隆，加入4ml含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，次日取2ml菌液，提取轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，測序比對正確的陽性克隆菌為含有pcDNA 3.1-p53載體的質(zhì)粒。
4.權(quán)利要求1所述的高效表達P53抑癌蛋白的T細胞在制備用于治療腫瘤的藥物方面的應用。
5.如權(quán)利要求4所述的應用，其特征是，所述腫瘤包括：肝癌、非小細胞肺癌、頭頸癌、惡性腦腫瘤、卵巢癌、膀胱癌、子宮頸癌、結(jié)腸直腸癌以及食管癌。
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