[發明專利]一種高效表達P53抑癌蛋白的T細胞、制備方法及應用

在審

• 申請號: 201711434089.2
• 申請日: 2017-12-26
• 公開（公告）號: CN108060135A
• 公開（公告）日: 2018-05-22
• 發明（設計）人: 王泰華;王欣;張剛;崔曉慧
• 申請（專利權）人: 東莞賽爾生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/66;C12N15/85;A61K35/17;A61P35/00
• 代理公司: 濟南誠智商標專利事務所有限公司 37105
• 代理人: 朱彩霞

1.一種高效表達P53抑癌蛋白的T細胞，其特征是，由p53真核表達載體轉染T細胞得到；

所述p53真核表達載體，是將p53基因連接至pcDNA 3.1載體中構建而成。

2.權利要求1所述的高效表達P53抑癌蛋白的T細胞的制備方法，其特征是，步驟為：

(1)構建穩定表達p53真核表達載體：將p53基因與pcDNA 3.1載體連接，構建p53真核表達載體pcDNA 3.1-p53；

(2)轉染免疫T細胞：將新鮮的T細胞加入含有10％FBS的RPMI 1640完全培養基中，用抗CD3、CD28抗體、IL-2刺激T細胞，第三天用lipofectamine 2000將構建好的pcDNA 3.1-p53載體轉染T細胞，篩選得到穩定過表達p53的T細胞株p53-T細胞。

3.如權利要求2所述的高效表達P53抑癌蛋白的T細胞的制備方法，其特征是，所述步驟(1)構建穩定表達p53真核表達載體，具體步驟是：

1-1目的基因獲取

合成的BamH I-p53-BamH I基因通過BamH I酶切后回收純化p53基因片段，備用；

1-2目的基因與載體連接

pcDNA 3.1(+)空載體經BamH I酶切回收后去磷酸化處理；將回收的p53片段與酶切過的pcDNA3.1(+)空載連接，16℃水浴過夜；

1-3連接載體轉化

將16μL上述連接產物全部加入100μL大腸桿菌DH5α感受態細胞中，冰浴30min，立即在42℃水浴中熱擊90s后移至冰上冰浴2min；加入400μL LB培養基，37℃，200rpm培養1h；滴加10μL菌液至含有100μg·mL-1氨芐青霉素的LB固體平板上，均勻涂布，培養皿于37℃培養箱中倒置培養約16h；

1-4陽性菌落篩選

挑選大腸桿菌單克隆，加入4ml含有氨芐青霉素的LB液體培養基中培養過夜，次日取2ml菌液，提取轉化質粒，測序比對正確的陽性克隆菌為含有pcDNA 3.1-p53載體的質粒。

4.權利要求1所述的高效表達P53抑癌蛋白的T細胞在制備用于治療腫瘤的藥物方面的應用。

5.如權利要求4所述的應用，其特征是，所述腫瘤包括：肝癌、非小細胞肺癌、頭頸癌、惡性腦腫瘤、卵巢癌、膀胱癌、子宮頸癌、結腸直腸癌以及食管癌。