[發明專利]一種高效表達P53抑癌蛋白的T細胞、制備方法及應用

在審

• 申請號: 201711434089.2
• 申請日: 2017-12-26
• 公開（公告）號: CN108060135A
• 公開（公告）日: 2018-05-22
• 發明（設計）人: 王泰華;王欣;張剛;崔曉慧
• 申請（專利權）人: 東莞賽爾生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/66;C12N15/85;A61K35/17;A61P35/00
• 代理公司: 濟南誠智商標專利事務所有限公司 37105
• 代理人: 朱彩霞

本發明提供一種高效表達P53抑癌蛋白的T細胞、制備方法及應用，本發明高效表達P53抑癌蛋白的T細胞，由p53真核表達載體轉染T細胞得到；所述p53真核表達載體，是將p53基因連接至pcDNA 3.1載體中構建而成。本發明建立高效表達p53的載體體系，以免疫T細胞為表達載體，可以高效表達不同亞型p53，更有效地發揮p53的抗腫瘤活性。本發明高效表達P53抑癌蛋白的T細胞可以用于制備用于治療腫瘤的藥物。

技術領域

本發明涉及分子細胞生物學領域，特別涉及P53抑癌蛋白的應用和轉化，以及用P53抑癌蛋白治療血液和實體瘤的免疫療法。

背景技術

p53蛋白是1979年由David Lane發現并根據其分子量大小命名的，它是核蛋白四聚體，通過幾種轉錄后修飾作用，如磷酸化、乙?；⒎核鼗?、類泛素化、甲基化等修飾，可以跟多種蛋白質及DNA相互作用[1]，影響精細、復雜的細胞調節過程。多種信號可以誘導p53激活，如DNA損傷、營養饑餓、熱休克、病毒感染、pH改變、缺氧和原癌基因激活等。特別地，p53作為轉錄因子，可以通過特異性綁定p53-效應元件(p53REs)激活或者抑制基因表達[2]。p53位于17號染色體的短臂上(17p 13.1)[3]，含有11個外顯子，10個內含子。其中除1號外顯子為無意編碼外，2-11號外顯子編碼393個氨基酸的蛋白。p53氨基酸序列中，93-292氨基酸區域是DNA結合區域以及人類腫瘤中的突變高發生區[4]。95％的p53堿基置換突變發生在氨基酸保守序列上(密碼子117–142、171–181、234–258和270–286)[5,6]。p53蛋白的N-端富含大量的氨基酸殘基，可以作為轉錄激活因子[7]；C-端寡聚區，包含DNA非特異性結合區域，可以識別并結合損傷的DNA[8]。如果p53基因錯意突變發生在特定的N-或者C-端區域，將會影響基因抑制腫瘤的功能。

p53基因是迄今為止已發現的與人類腫瘤發生相關性最高的抑癌基因，但是這種基因的突變存在著致瘤性轉化[9]。據報道，超過50％人類惡性腫瘤的發生是由于P53基因突變引起的，超過90％P53基因點突變發生在中央核心結構域上[10]。其中約73％突變屬于由錯義突變引起的蛋白構象的改變[11,12]。一方面，發生點突變的p53對腫瘤相關信號通路的調節失活，轉而易于發生癌變；另一方面，即使p53不存在突變，但是p53參與的信號通路被干擾依然可以使人體罹患癌癥[13]。卵巢癌中p53基因突變率最高，主要為點突變，29％～74％。Okamoto等報道，80％卵巢癌有p53等位基因丟失，29％卵巢癌有p53基因突變。子宮內膜癌中，32％的病人伴有p53等位基因丟失。宮頸癌中的突變率較低，約3％～7％。另外，70％～80％肺癌患者也存在p53基因突變。通過免疫組化等手段可以檢測到突變的p53蛋白大量聚集在細胞核內[14,15]。

隨后研究發現，p53不僅具有抑制作用，同時還可以維持各種細胞功能的發揮，因而被稱作“基因組的守護者”[16,17]。現在認為抑癌基因的突變相比較于癌基因的突變對于癌癥的發生更加危險。通過使用適當的腫瘤抑制基因或去除掉致癌的相應癌基因是誘導癌細胞死亡的一種很有希望的抗腫瘤治療策略。外源性p53基因的異位表達能有效的誘導許多p53失活的腫瘤細胞的死亡。為了誘導外源性p53基因的表達，在許多種癌癥的臨床前體外和體內實驗中經常使用腺病毒載體來表達p53。這些癌癥包括：非小細胞肺癌，頭頸癌，惡性腦腫瘤，卵巢癌，膀胱癌，子宮頸癌，結腸直腸癌以及食管癌等。