[發明專利]攜帶嵌合抗原受體的免疫細胞外泌體的制備方法及其應用

有效

• 申請號: 201711432948.4
• 申請日: 2017-12-26
• 公開（公告）號: CN108315305B
• 公開（公告）日: 2020-11-06
• 發明（設計）人: 胡適;傅文燕
• 申請（專利權）人: 灃潮醫藥科技（上海）有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;A61K35/17;A61P35/00;A61P31/00;A61P37/02
• 代理公司: 上海順華專利代理有限責任公司 31203
• 代理人: 陸林輝

1.一種攜帶CAR的免疫細胞外泌體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

A)制備CAR免疫細胞：

B)對CAR免疫細胞進行抗原特異性活化：

采用的活化劑是特異性靶點的可溶性重組蛋白、表達特異性靶點的工程細胞或表達特異性靶點的腫瘤細胞；所述的特異性靶點指的是CAR免疫細胞中的scFv針對的抗原靶點，即CAR免疫細胞靶向的特異性靶點；活化的方法為在體外的培養體系中加入抗原蛋白或固化的抗原蛋白、直接共培育CAR免疫細胞和表達特異性靶點的滅活后工程細胞、直接共培育CAR免疫細胞和表達特異性靶點的滅活后腫瘤細胞；

C)收集制備CAR免疫細胞外泌體：

采集培養上清，收集制備CAR免疫細胞外泌體；

D)CAR外泌體的純化和富集：

向步驟C中制得的外泌體重懸液中加入特異性抗原包被的磁性體，即CAR捕獲磁體，所述磁性體上含有與CAR蛋白特異性結合的重組靶點蛋白抗原；孵育后將重懸液置于磁場中，除去上清液后加入緩沖液，加入分選柱，利用緩沖液洗脫分選柱上滯留的外泌體；將上清液加入分選柱后，先流出的是無抗原結合能力的外泌體，然后采用緩沖液洗脫分選柱，流出的即為具有抗原結合能力、攜帶CAR的免疫細胞外泌體；根據最初收集的培養基的體積不同，酌情加入PBS重懸，用Bradford試劑盒檢測總蛋白濃度，-80℃分裝保存。

2.根據權利要求1所述的攜帶CAR的免疫細胞外泌體的制備方法，其特征在于，所述的步驟A的免疫細胞是T細胞或NK細胞；所述的免疫細胞的來源是患者自身或健康志愿者。

3.根據權利要求1所述的攜帶CAR的免疫細胞外泌體的制備方法，其特征在于，所述的步驟A的免疫細胞為健康志愿者來源的T細胞，CAR免疫細胞的制備方法按照以下步驟實施：

(a)獲得細胞樣本并分離和激活，所述樣本為T細胞或T細胞的祖細胞；

(b)構建scFv-CD8hinge and TM-4-1BB-CD3、scFv-hinge-TM-CD28-CD3、scFv-hinge-CD28-4-1BB-CD3的病毒載體；

(c)制作重組質粒并包裝病毒；

(d)病毒感染T細胞；

(e)體外培養擴增CAR-T細胞群體。

4.根據權利要求1所述的攜帶CAR的免疫細胞外泌體的制備方法，其特征在于，所述的步驟B中CAR免疫細胞中的scFv針對的抗原靶點是EGFR，HER2或CD20。

5.根據權利要求1所述的攜帶CAR的免疫細胞外泌體的制備方法，其特征在于，所述的步驟B采用的活化劑為表皮生長因子EGFR胞外段重組蛋白、磁珠交聯的EGFR胞外段重組蛋白、表達EGFR的CHO細胞、表達EGFR的MDA-MB-231細胞、磁珠交聯的HER2胞外段重組蛋白、表達HER2的BT474細胞或表達CD20的Raji細胞。

6.根據權利要求1所述的攜帶CAR的免疫細胞外泌體的制備方法，其特征在于，所述的步驟C收集制備CAR免疫細胞外泌體的方法為：將收集的培養上清于4℃、2000g離心10分鐘，以去除死細胞和大的碎片；小心將上清液轉移到新的無菌離心管中，于4℃、10000g離心30分鐘，以去除細胞器及小顆粒；小心將上清液轉移到無菌超速離心管中，于4℃，110000g超速離心70分鐘，小心棄去上清，再加PBS清洗一次，于4℃，110000g超速離心70分鐘，得到的沉淀即為外泌體。

7.一種采用如權利要求1-6任一所述的制備方法制備得到的攜帶CAR的免疫細胞外泌體，所述的外泌體攜帶CAR蛋白，平均直徑在30-150nm。

8.一種如權利要求7所述的攜帶CAR的免疫細胞外泌體及其組合物在制備抗腫瘤藥物中的應用。

9.一種制劑，所述的制劑為包含如權利要求7所述的攜帶CAR的免疫細胞外泌體的組合物。