[發明專利]一種消化RPE細胞的方法

在審

• 申請號: 201711430944.2
• 申請日: 2017-12-26
• 公開（公告）號: CN109957545A
• 公開（公告）日: 2019-07-02
• 發明（設計）人: 范國平;閆占海;方攀峰;李寧;謝磊
• 申請（專利權）人: 江蘇艾爾康生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N5/079
• 分類號: C12N5/079;C12N9/50;C12N9/00
• 代理公司: 北京安杰律師事務所 11627
• 代理人: 袁沁菲

本發明公開了一種消化RPE細胞以解除其細胞貼壁狀態的方法，包括以下步驟：(1)使用1×TrypLE select，使其均勻覆蓋于RPE細胞；(2)使用Dispase II溶液，使其均勻覆蓋于RPE細胞，其中步驟(1)和(2)是分步實施。

技術領域

本發明總體上涉及生命科學領域，具體涉及一種RPE細胞解除貼壁狀態的消化方法。

背景技術

視網膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelium，簡稱RPE)是由單層色素上皮細胞所構成，排列十分規則。細胞呈多角形，細胞分為三部分，即頂部、體部和基底部。RPE是位于視網膜外部的連續單層細胞，因其篩子狀的形態和胞質內豐富的黑色素而得名，它們在視網膜細胞的維持和自我更新上發揮重要的功能，如：吞噬消化脫落的光感受器細胞的OS；促進視循環中重要的介質11-順視黃醛的再生；調節眼內的免疫反應；參與形成視網膜-血管屏障等。

老年性黃斑變性亦稱年齡相關性黃斑變性(age-related maculardegeneration，簡稱AMD)。大多始發于50歲上下，年齡越大，患病率越高。發病與性別、種族無明顯關系。雙眼同時或先后受害。AMD的癥狀和診斷主要癥狀是中心視力下降，視野中心有黑影遮擋，及視物會變形。由于本病原因還不明確，所致至今尚無有效治療和根本性的預防措施。AMD主要表現為視網膜色素上皮細胞對視細胞外節盤膜吞噬消化能力下降，結果使未被完全消化的盤膜殘余小體潴留于基底部細胞原漿中，并向細胞外排除沉積于Bruch膜，形成玻璃膜疣。AMD分為干性和濕性兩種，其中，干性AMD更為常見，他是由于RPE進行性營養不良造成的脈絡膜毛細血管和光受體缺失的一種疾病。濕性AMD的典型特征是有脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)生成，從而造成嚴重的視力喪失。除了細胞替代治療，目前尚無逆轉這一退行性過程并回復視力的有效辦法。

RPE細胞治療AMD的試驗顯示通過在視網膜下腔移植正常RPE細胞，能夠延緩進行性的視覺功能喪失。RPE細胞移植在RPE遺傳缺陷動物模型和AMD病人上的試驗，都顯示能夠延緩視網膜的退行性病變，改善視覺功能。所以RPE細胞在不久的將來有望成為干細胞藥物，但是由于RPE細胞本身的特殊性，成為干細胞藥物要克服生產工藝上的兩大難點，其中之一是RPE細胞解除貼壁狀態的方法。本專利的消化方法旨在于解決此問題。

發明內容

本發明一方面公開了一種消化酶組合物，包括重組酶TrypLE和中性蛋白酶Dispase II，使用所述酶組合物可以解除RPE細胞的貼壁狀態。

其中在一個實施例中，重組酶TrypLE優選為1×TrypLE select。

在另一個實施例中，中性蛋白酶Dispase II的濃度選自0.5mg/mL至4.0mg/mL中的任一濃度，優選選自2.0mg/mL至4.0mg/mL中的任一濃度，更優選為2.0mg/mL。

另一方面，本發明公開了一種消化酶組合物在制備用于解除RPE細胞貼壁狀態的試劑或試劑盒中的應用，其中所述消化酶組合物包括重組酶TrypLE和中性蛋白酶DispaseII。

另一方面，本發明也公開了一種消化酶組合物在解除RPE細胞貼壁狀態的用途，其中，所述消化酶組合物包括重組酶TrypLE和中性蛋白酶Dispase II。

在一個實施例中，所述中性蛋白酶Dispase II的濃度選自0.5mg/mL至4.0mg/mL中的任一濃度，優選選自2.0mg/mL至4.0mg/mL中的任一濃度，更優選為2.0mg/mL。

另一方面，本發明還公開了一種消化RPE細胞以解除其細胞貼壁狀態的方法，包括以下步驟：

(1)使用1×重組酶TrypLE，使其均勻覆蓋于RPE細胞；和

(2)使用中性蛋白酶Dispase II溶液，使其均勻覆蓋于RPE細胞；