[發明專利]羊種布魯氏菌per基因缺失菌株、其構建方法及應用

在審

• 申請號: 201711430173.7
• 申請日: 2017-12-26
• 公開（公告）號: CN108048383A
• 公開（公告）日: 2018-05-18
• 發明（設計）人: 焦寒偉;帥學宏;黃慶洲;郭芳芳;伍莉;陳吉軒;甘玲;羅獻梅;王紅均
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;C12N15/66;C12N15/65;C12N15/61;A61K39/10;A61P31/04;C12R1/01
• 代理公司: 北京君智知識產權代理事務所(普通合伙) 11305
• 代理人: 黃綠雯

1.一株羊種布魯氏菌(Brucella melitensis,B.melitensis)M5-90-Δper，所述菌是用卡那霉素抗性基因替換羊種布魯氏菌M5-90的per基因編碼區構建得到的。

2.羊種布魯氏菌M5-90-Δper的構建方法，所述方法包括以下步驟：

(1)根據羊種布魯氏菌M5-90的基因序列和pEGFP-N1載體的基因序列以及pGEM-7Zf(+)載體特點，設計構建per基因缺失株所需的相應引物；

(2)提取羊種布魯氏菌M5-90菌的基因組并于-20℃保存；

(3)以步驟(2)得到的基因組為模板，擴增per基因左同源臂per-C端、per-N端，以pEGFP-N1質粒為模板，擴增卡那霉素抗性基因Kana；

(4)分別回收和純化步驟(3)的PCR擴增產物，得到per-C端、per-N端和Kana基因

(5)將步驟(4)得到的per-C端、per-N端和Kana基因分別與pMD20-T載體4℃連接，分別得到重組質粒；

(6)步驟(5)得到的連接產物分別轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，通過測序確認得到重組質粒pMD20-per-C、pMD20-per-N和pMD20-Kana；

(7)分別利用Sma I和Sac I對重組質粒pMD20-per-C進行雙酶切，利用Sma I和Sac I對自殺載體pGEM-7Zf(+)進行雙酶切，利用Xho I與Sma I分別對重組質粒pGEM-C和pMD20-Kana進行雙酶切，膠回收試劑盒純化目的片段，得到粘性末端，用T4連接酶將粘性末端4℃過夜連接；將連接產物轉化DH5α感受態細胞，篩選陽性克隆，提取質粒后用Apa I與Xho I雙酶切鑒定，鑒定正確的質粒命名為pGEM-C-K-N，對所得質粒進行測序

(8)將羊種布魯氏菌M5-90菌劃線培養于無抗性的TSA固體培養基上，培養后挑取單菌落接種于無抗性TSB液體培養基中，37℃、220rpm培養48h后按照體積比1:1000接種于10mL無抗性TSB中；當OD值為0.389時，離心處理后棄上清，將菌體置于冰上預冷30min，然后4000rpm離心10min，棄上清；再用5mL 10重量％甘油水溶液重懸菌體，混勻后8000rpm離心2min，棄上清；重復重懸步驟3次；再用預冷的10重量％甘油水溶液2.5mL重懸菌體，混勻后分裝，得到羊種布魯氏菌M5-90感受態細胞，-70℃保存備用；

(9)將同源重組質粒pGEM-C-K-N轉化步驟(8)的羊種布魯氏菌M5-90感受態細胞，確認per基因缺失，得到羊種布魯氏菌M5-90-Δper。

3.權利要求2的羊種布魯氏菌(Brucella melitensis,B.melitensis)M5-90-Δper在制備布魯氏菌減毒疫苗中的應用。

4.權利要求2的羊種布魯氏菌(Brucella melitensis,B.melitensis)M5-90-Δper在降低感染細胞自噬水平中的應用。

5.per基因缺失在降低羊種布魯氏菌對RAW264.7細胞自噬水平的應用。