[發明專利]羊種布魯氏菌per基因缺失菌株、其構建方法及應用

在審

• 申請號: 201711430173.7
• 申請日: 2017-12-26
• 公開（公告）號: CN108048383A
• 公開（公告）日: 2018-05-18
• 發明（設計）人: 焦寒偉;帥學宏;黃慶洲;郭芳芳;伍莉;陳吉軒;甘玲;羅獻梅;王紅均
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;C12N15/66;C12N15/65;C12N15/61;A61K39/10;A61P31/04;C12R1/01
• 代理公司: 北京君智知識產權代理事務所(普通合伙) 11305
• 代理人: 黃綠雯

發明提供一株羊種布魯氏菌(Brucella melitensis,B.melitensis)M5?90?Δper，所述菌是用卡那霉素抗性基因替換羊種布魯氏菌M5?90的per基因編碼區構建得到的。本發明以羊種布魯式菌M5?90為出發菌株，以其基因組為模板，通過擴增per基因上、下游同源臂，同時利用卡那霉素抗性基因替換per基因編碼區，構建pGEM?Δper同源重組質粒，將該質粒電轉化羊種布魯式菌M5?90感受態細胞，所得陽性轉化子即為per基因缺失的羊種布魯式菌M5?90?Δper。本發明的M5?90?Δper株為布魯氏菌介導的細胞自噬與感染機制奠定了重要基礎。

【技術領域】

本發明涉及生物技術領域，特別涉及一株羊種布魯氏菌per基因缺失菌株，還涉及所述菌株的構建方法及其應用。

【背景技術】

布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏桿菌(Brucella)引起的一種人畜共患傳染病，該病主要傳染對象羊，其次為豬和牛，每年給我國畜牧業造成巨大的經濟損失，同時嚴重威脅著人類的健康。近年來，該病在我國范圍內有逐步回升的趨勢。目前，該病的預防主要依賴于疫苗免疫，特別是在發展中國家，接種疫苗是預防該病的主要手段。我國預防該病的疫苗之一為M5-90，由哈爾濱獸醫研究所自主研發的M5-90疫苗株能夠在一定程度上預防綿羊和山羊布魯氏菌病，但該疫苗也存在著許多缺陷，如該疫苗株接種動物后毒力還很強、容易引起懷孕母畜流產和無法區分自然免疫和疫苗免疫，使得該疫苗的應用具有很大的局限性，因此，該疫苗的進一步改造對于成功防治布魯氏菌病具有十分重大的意義。

研究發現，布魯氏菌的毒力因子主要包括外膜蛋白(Outer membrane protein,OMP)成分和脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)成分。布魯氏菌脂多糖主要由脂質A(LipidA)、O-鏈抗原和核心多糖組成，而per基因編碼的過骨胺合成酶則是布魯氏菌脂多糖O-鏈抗原合成的關鍵酶。布魯氏菌脂多糖分為光滑型(Soomth,S)和粗糙型(Rough,R)兩種，當per基因缺失導致布魯氏菌脂多糖O-鏈抗原不能合成時，使得光滑型的羊種布魯氏菌M5-90(Brucella melitensis,B.melitensis)就變成了粗糙型的B.melitensis M5-90，并使布魯氏菌的毒力發生衰減或消失。

per基因編碼的過骨胺合成酶參與光滑型布魯氏菌脂多糖O側鏈的合成，在B.abortus中，該基因的缺失導致其不能合成LPS，從而使光滑型布魯氏菌轉變為粗糙型，并使布魯氏菌的毒力發生衰減或消失。

【發明內容】

本發明的目的是克服現有技術缺陷，通過基因工程技術獲得一株具有減毒疫苗應用意義的羊種布魯式菌。

為了實現上述目的，本發明的思路是以羊種布魯式菌(B.melitensis)M5-90為出發菌株，以其基因組為模板，通過擴增per基因上、下游同源臂，同時利用卡那霉素抗性基因替換per基因編碼區，構建pGEM-Δper同源重組質粒，將該質粒電轉化羊種布魯式菌M5-90感受態細胞，所得陽性轉化子即為per基因缺失的羊種布魯式菌M5-90-Δper。

為此，本發明提供一株羊種布魯氏菌(Brucella melitensis,B.melitensis)M5-90-Δp er，所述菌是用卡那霉素抗性基因替換羊種布魯氏菌M5-90的per基因編碼區構建得到的。

羊種布魯氏菌M5-90-Δper的構建方法包括以下步驟：

(1)根據羊種布魯氏菌M5-90的基因序列和pEGFP-N1載體的基因序列以及p GEM-7Zf(+)載體特點，設計構建per基因缺失株所需的相應引物；

(2)提取羊種布魯氏菌M5-90菌的基因組并于-20℃保存；

(3)以步驟(2)得到的基因組為模板，擴增per基因左同源臂per-C端、per-N端，以pEGFP-N1質粒為模板，擴增卡那霉素抗性基因Kana；