[發明專利]一種真皮成纖維細胞規模化生產系統

在審

• 申請號: 201711430115.4
• 申請日: 2017-12-26
• 公開（公告）號: CN107881144A
• 公開（公告）日: 2018-04-06
• 發明（設計）人: 方攀峰;陳爽;閆占海
• 申請（專利權）人: 江蘇艾爾康生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 北京安杰律師事務所11627
• 代理人: 袁沁菲

技術領域

本發明總體上涉及細胞工程技術領域，具體涉及一種成人自體真皮成纖維細胞的規模化生產系統。

背景技術

目前細胞代替療法正在國內外逐步展開。在臨床皮膚疾病和創傷治療領域，如皮膚缺損治療、皮膚抗衰老治療、人工皮膚等領域，除了通用化藥治療以為，臨床醫師正在嘗試使用生物活性藥品或制劑，包括細胞制劑及其衍生品。

細胞制品，在細胞的取材方面，自體細胞免疫原性低，最容易被使用者接受，進入臨床使用。自體細胞取材部位、取材面積、生產速度、產品活力和純度，直接關系細胞產品的生產時間和產量。國內外經過多年研究，已經產生了多種培育人體皮膚細胞的方法，但各家做法方法不一，培育質量也參差不齊。

本發明對皮膚成纖維細胞活體取材部位、手術及組織消毒方法、原代培養方法、細胞表型篩選、細胞成品鑒定、生產全過程質檢系統，進行了更新改進，得到穩定的取材量-細胞獲得量關系，以及穩定生產的方法。該方法可以在近乎穩定的時間內獲得高純度、高質量的、穩定產量的I型真皮成纖維細胞。

發明內容

本發明的一個方面，提供了成人自體真皮成纖維細胞的生產方法，包括活組織消毒和運輸方法、真皮組織包埋培養方法，細胞表型篩選方法、細胞鑒定方法。

本發明提供了一種真皮成纖維細胞的生產方法，包括以下步驟：

(1)采集皮膚活組織，其中包括手術區消毒過程和組織消毒過程，在所述手術區消毒過程中使用的消毒方式包括酒精或碘伏擦拭采集的皮膚活組織，在所述組織消毒過程中使用的消毒方式至少包括清洗液淋洗真皮部位。

在一個實施例中，上述真皮成纖維細胞的生產方法還包括以下步驟：

(2)原代細胞分離和培養；

(3)細胞表型篩選，其中選擇I型成纖維細胞進行下一步操作；

(4)擴大培養和收集細胞。

在本發明的一個實施例中，在步驟(1)中，所述手術區消毒過程中使用的消毒方式包括酒精擦拭和碘伏擦拭。

在本發明的一個實施例中，在步驟(1)中，所述組織消毒過程中使用的消毒方式還包括酒精擦拭表皮層和清洗液淋洗真皮部位。

在本發明的一個具體實施例中，在步驟(1)中，使用的消毒組合為：手術區通過酒精擦拭和碘伏擦拭消毒，組織通過酒精擦拭表皮層和清洗液淋洗真皮部位的方式消毒。

在本發明的一個具體實施例中，在步驟(1)中，手術區消毒3遍，組織被消毒3次。

在本發明的一個實施例中，在步驟(3)中，細胞表型篩選后，進行表型檢測、流式檢測和蛋氨酸檢測,其中所述表型檢測優選通過吉薩姆染色后顯微鏡觀察形態確定，所述流式檢測優選通過成纖維細胞陽性標志物陽性率大于95％和陰性標志物陰性率小于5％確定。

在本發明的一個實施例中，所述成纖維細胞陽性標志物選自CD73、CD90、和CD105所組成的組，所述成纖維細胞陰性標志物基因選自CD31和CD34所組成的組。

在本發明的一個具體實施例中，所述成纖維細胞陽性標志物為CD73、CD90、和CD105，所述成纖維細胞陰性標志物基因為CD31和CD34。

在上述的生產方法中，在步驟(2)中，所述原代細胞培養的方法為膠原包埋組織培養法：在培養容器中預鋪一定厚度一定濃度的膠原蛋白，將組織塊完全埋入膠原中，再膠原上層加入培養基，靜置培養。

在上述的生產方法中，在步驟(2)中，所述的原代細胞培養中使用的培養基配方為DMEM高糖培養基、15％FBS、1％NEAA、1％L-谷氨酰胺、和1％丙酮酸鈉。

在上述的生產方法中，在步驟(2)中，其中，經過原代組織采集獲得的細胞，通過病毒檢測和微生物檢測后，確定該細胞是否可用于后續的細胞原代培養還是廢棄。

其中，檢查項目包括微生物安全性檢測(諸如細菌檢測、真菌檢測、支原體檢測、內毒素檢測)和病毒檢測(諸如HIV、HBV、HCV、CMV、TP)檢測，抽檢樣本為組織提供者的血液。所有檢測結果必須為陰性。

在上述的生產方法中，在步驟(4)中，其中，經過擴大培養后的細胞，通過微生物檢測，合格的被收集，不合格的廢棄。

附圖說明

圖1示出細胞生產流程圖。

圖2示出細胞生產數量和時間曲線圖。

圖3示出不同表型的成纖維細胞的形態圖(物鏡光學倍數4倍)。

圖4示出接種組織后不同天數后細胞形態圖(物鏡光學倍數10倍)。

圖5示出原代細胞包埋式培養細胞狀態圖(物鏡光學倍數4倍)。

圖6示出細胞標志物鑒定的流式細胞圖。