[發明專利]一種重組酶恒溫擴增結合免疫膠體金試紙條檢測沙門氏菌的試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 201711427791.6
• 申請日: 2017-12-26
• 公開（公告）號: CN108060209A
• 公開（公告）日: 2018-05-22
• 發明（設計）人: 任士常;張志紅
• 申請（專利權）人: 中科智測(天津)科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/10;G01N33/569;C12R1/42
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司 12209
• 代理人: 韓曉梅

本發明公開了一種重組酶恒溫擴增結合免疫膠體金試紙條檢測沙門氏菌的試劑盒，所述試劑盒包括沙門氏菌基因引物組DNA、重組酶恒溫擴增試劑盒、無菌蒸餾水和核酸免疫膠體金試紙條。本發明試劑盒操作簡便，非常適用于現場檢測；檢測成本低，整個檢測過程僅需20min；靈敏度比PCR結合瓊脂糖凝膠電泳檢測限高104倍，因此其可被廣泛用于各種致病菌的檢測，能夠準確、靈敏、快速地檢測沙門氏菌。

技術領域

本發明屬于食品檢測技術領域，涉及食品中的沙門氏菌檢測，尤其是一種重組酶聚合酶恒溫擴增結合免疫膠體金試紙條檢測沙門氏菌的試劑盒及利用該試劑盒檢測沙門氏菌的方法。

背景技術

近年來，由于食品安全事件的頻發，世界衛生組織及消費者越來越重視食品安全問題。沙門氏菌是一種革蘭氏陰性菌桿菌，在自然界中分布廣泛，極易污染肉類、海產品、蛋類等許多食品，消費者食用被沙門氏菌污染的食品就會引發食物中毒。在我國，每年由細菌引起的食物中毒中，沙門氏菌引起的食物中毒居首位，約占40％。檢測和鑒定沙門氏菌的方法主要包括傳統的細菌培養與生化鑒定和PCR方法。傳統培養方法耗時長，大概2-3天，不適合于現場檢測。PCR方法操作復雜，需要專門的操作人員和昂貴的熱循環裝置。這兩種檢測方法不能滿足食品安全檢測要求快速、便攜、準確、特異性和靈敏度高的要求。

為了適用現場檢測的要求，恒溫擴增方法得到了廣泛的應用，其最大的優點是可以在恒定的溫度下發生反應。應用恒溫擴增技術檢測致病菌，簡單的數字水浴鍋可以取代昂貴的PCR儀，大大降低了檢測成本。恒溫擴增方法主要包括環介導等溫擴增(LAMP)、滾環擴增(RCA)、解旋酶為基礎的擴增(HDA)、重組酶擴增(RPA)。在這些恒溫擴增方法中，解旋酶擴增(RPA)以操作簡單、反應溫度低(37℃-42℃)、擴增所需時間短(5-25min)而優于其他的恒溫擴增方法。重組酶擴增是通過模擬DNA體內擴增，利用重組酶、單鏈結合蛋白和鏈置換DNA聚合酶，將目標DNA擴增數十億倍。重組酶能夠不通過加熱就解開雙鏈DNA。RPA反應開始的時候，重組酶結合單鏈DNA(引物)，形成核酸蛋白復合體。這些復合體能夠掃描與引物序列互補的目標雙鏈DNA。接著，核酸蛋白復合體侵入5'端位點形成D狀環。單鏈結合蛋白與被置換單鏈結合使其穩定。同時，重組酶離開寡核苷酸的3'端，降解后被DNA聚合酶利用。之后，鏈置換DNA聚合酶結合在核酸蛋白復合體的游離3'端，進行鏈延伸，形成新的互補鏈。在鏈延伸的過程中，新合成的單鏈與原始互補鏈配對。以上步驟循環進行，就可以實現DNA的指數增長。

傳統檢測恒溫擴增產物的方法是使用瓊脂糖凝膠電泳，該方法耗時長，并且需要凝膠成像系統，不符合食源性致病菌現場檢測簡便、快速的要求。膠體金免疫檢測試紙條是20世界90年代發展起來的一項新型體外診斷技術。試紙條制作簡單，價格便宜，使用方便，并且保存期長。目前關于將試紙條與重組酶恒溫擴增結合起來檢測沙門氏菌的分析方法未見報道。該技術操作簡單快速，結果容易判定，無需復雜的儀器和專業的技術人員，具有很強的現場應用價值。

通過檢索，尚未發現與本發明申請相關的專利公開文獻。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足之處，提供一種重組酶恒溫擴增結合免疫膠體金試紙條檢測沙門氏菌的試劑盒及利用該試劑盒檢測沙門氏菌的方法，該試劑盒具有高靈敏度、高特異性、可視化、操作簡單、便攜式的特點。

本發明解決其技術問題是采取以下技術方案實現的：

一種重組酶恒溫擴增結合免疫膠體金試紙條檢測沙門氏菌的試劑盒，所述試劑盒包括沙門氏菌基因引物組DNA、重組酶聚合酶恒溫擴增試劑盒、無菌蒸餾水和核酸免疫膠體金試紙條：

其中，所述沙門氏菌基因引物組DNA為沙門氏菌恒溫擴增的正向引物和反向引物，所述正向引物序列為SEQ1：5’-digoxinCTACAAGCATGAAATGGCAGAACAGCGTCG-3’，所述反向引物序列為SEQ2：5’-biotin-CAACCAGATAGGTAGGTAATGGAATGACGA-3’；