[發明專利]一種重組酶恒溫擴增結合免疫膠體金試紙條檢測沙門氏菌的試劑盒及檢測方法在審
| 申請號： | 201711427791.6 | 申請日： | 2017-12-26 |
| 公開（公告）號： | CN108060209A | 公開（公告）日： | 2018-05-22 |
| 發明（設計）人： | 任士常;張志紅 | 申請（專利權）人： | 中科智測(天津)科技有限公司 |
| 主分類號： | C12Q1/6844 | 分類號： | C12Q1/6844;C12Q1/10;G01N33/569;C12R1/42 |
| 代理公司： | 天津盛理知識產權代理有限公司 12209 | 代理人： | 韓曉梅 |
| 地址： | 300457 天津市濱海新區天津經濟*** | 國省代碼： | 天津;12 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 重組 恒溫 擴增 結合 免疫 膠體 試紙 檢測 沙門氏菌 試劑盒 方法 | ||
1.一種重組酶恒溫擴增結合免疫膠體金試紙條檢測沙門氏菌的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括沙門氏菌基因引物組DNA、重組酶聚合酶恒溫擴增試劑盒、無菌蒸餾水和核酸免疫膠體金試紙條：
其中，所述沙門氏菌基因引物組DNA為沙門氏菌恒溫擴增的正向引物和反向引物，所述正向引物序列為SEQ1：5’-digoxinCTACAAGCATGAAATGGCAGAACAGCGTCG-3’，所述反向引物序列為SEQ2：5’-biotin-CAACCAGATAGGTAGGTAATGGAATGACGA-3’；
所述核酸免疫膠體金試紙條包括PVC背板、樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸水紙，所述PVC背板沿水平方向設置，該PVC背板上由左至右依次相連接設置樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸水紙，各部分在相鄰處重疊設置，所述硝酸纖維素膜上沿水平方向平行間隔設置檢測線和質控線，所述檢測線和質控線沿縱向設置，所述檢測線處的硝酸纖維素膜上包被設置鏈霉親和素，所述質控線處的硝酸纖維素膜上包被設置兔抗鼠二抗，所述結合墊上包被設置高辛抗體-膠體金標記物；
所述核酸免疫膠體金試紙條在使用過程中，質控線若無顏色，證明該核酸免疫膠體金試紙條失效。
2.根據權利要求1所述的重組酶恒溫擴增結合免疫膠體金試紙條檢測沙門氏菌的試劑盒，其特征在于：所述核酸試紙條的制備方法如下：
⑴采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金；
⑵取1ml步驟⑴中的膠體金加入到無菌離心管中，將1mg/ml鼠抗地高辛單克隆抗體10ul加入到上述膠體金中，制得抗地高辛抗體-膠體金標記物；
⑶將步驟⑵中制備抗地高辛抗體-膠體金標記物包被于結合墊上；
⑷在試紙條的硝酸纖維素膜上包被鏈霉親和素作為檢測線，并將兔抗鼠二抗包被在硝酸纖維素膜上作為質控線；試紙條使用過程中，質控線若無顏色，證明試紙條失效；
⑸在PVC背板上按順序粘貼樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜、吸水紙，即得核酸免疫膠體金試紙條。
3.根據權利要求2所述的重組酶恒溫擴增結合免疫膠體金試紙條檢測沙門氏菌的試劑盒，其特征在于：所述樣品墊和硝酸纖維素膜購自美國Millipore公司，所述結合墊、吸水紙和PVC背板購自上海金標生物科技公司，所述鏈霉親和素購自sigma公司，所述鼠抗地高辛單克隆抗體和兔抗鼠多克隆抗體購自Abcam公司。
4.根據權利要求2所述的重組酶恒溫擴增結合免疫膠體金試紙條檢測沙門氏菌的試劑盒，其特征在于：所述膠體金的制備方法如下：
采用檸檬酸三鈉還原氯金酸法制備膠體金：
先取200ml去離子水倒入三角燒瓶中，于恒溫電磁力攪拌器上加熱至沸騰一分鐘，清洗三角燒瓶，之后倒掉沸水；取99ml去離子水到三角燒瓶中，取1ml的質量濃度為1％的HAuCl
5.根據權利要求1所述的重組酶恒溫擴增結合免疫膠體金試紙條檢測沙門氏菌的試劑盒，其特征在于：所述重組酶聚合酶恒溫擴增試劑盒購于TwistDx Ltd.Babraham,UK公司。
6.根據權利要求1所述的重組酶恒溫擴增結合免疫膠體金試紙條檢測沙門氏菌的試劑盒，其特征在于：所述重組酶聚合酶恒溫擴增試劑盒能夠擴增檢測核酸分子，擴增片段的長度為188bp，目標DNA的濃度≥20fg。
7.根據權利要求1所述的重組酶恒溫擴增結合免疫膠體金試紙條檢測沙門氏菌的試劑盒，其特征在于：所述重組酶聚合酶恒溫擴增試劑盒擴增的溫度為39℃，擴增時間為10min。
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