[發明專利]一種檢測蕪菁花葉病毒所用PCR引物及其檢測方法

在審

• 申請號: 201711426414.0
• 申請日: 2017-12-26
• 公開（公告）號: CN108060267A
• 公開（公告）日: 2018-05-22
• 發明（設計）人: 楊彩霞;付晶晶;韓彤;廖一鳴;李梁;侯秋實;于美春;王筠竹
• 申請（專利權）人: 沈陽大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 沈陽技聯專利代理有限公司 21205
• 代理人: 趙越

1.一種檢測蕪菁花葉病毒所用PCR引物，其特征在于，所述一種檢測蕪菁花葉病毒所用到的PCR引物具體為：

上游引物TuMV-CP-F（SEQ IN NO.1）：5’- tgtgtwtaycaccaggca -3’；

下游引物TuMV-CP-R（SEQ IN NO.2）：5’-cataagcgagaatactaacgag-3’。

2.一種檢測蕪菁花葉病毒所用PCR引物檢測方法，其特征在于，所述方法為檢測蕪菁花葉病毒所用引物在判定蕪菁花葉病毒中的應用，用于檢測確定蘿卜樣品是否受到辣蕪菁花葉病毒（TuMV）的侵染；包括如下步驟：

（1）提取待檢測蘿卜樣品的總RNA，冰上備用；提取方法如下：

植物總RNA提取采用TRIzol法，具體實驗步驟按照如下進行：

1）稱取0.2g的蘿卜病葉葉片，放于液研缽中，加入氮中并研磨成粉末狀；將其轉移至1.5ml RNase-free Eppendorf 管中，加入1ml TRIzol 試劑，室溫放置10min使細胞充分裂解；

2）4℃，12000rpm/min 離心15 min，收集上清，加入等體積的氯仿，劇烈振蕩后，混勻，室溫靜止3 min；

3）4℃，12000rpm/min 離心15 min，收集上清液，加入0.6倍體積的異丙醇，混勻后室溫靜止10 min；

4）4℃，12000rpm/min 離心15 min，棄去上清液，加入1 ml 75% 無水乙醇洗滌沉淀；

5）4℃，12000rpm/min 離心10 min，棄去上清液；

6）室溫干燥后，加入適量體積的 RNase-free H2O溶解沉淀；

（2）依據DNA第一條鏈合成試劑盒進行反轉錄；以該cDNA為模板進行PCR擴增；

cDNA第一條鏈合成：

PCR體系設計如下：

使用上述模板進行PCR擴增，在微量PCR管中依次加入cDNA 2μl，上游引物 1μl，下游引物 1μl，dNTP 1μl，10*Taq Buffer 2.5μl，Taq 0.2μl，補滅菌水至25μl；

反應程序為：95℃預變性5min，（94℃變性40s，50℃退火40s，72℃延伸50s）實驗進行40個循環，72℃終延伸10min；

（3）對（2）中的PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到陽性條帶，目的條帶大小預計約為940bp，經測序后Blast比對，表明樣品中含有蕪菁花葉病毒；

（4）為進一步確定該樣品中是否含有蕪菁花葉病毒，繼續如下實驗；將（3）中陽性PCR產物樣品進行切膠回收，回收產物直接與PMD18-T載體進行連接，轉化到DH-5α菌株中進行培養，挑取陽性單菌落進行菌液復蘇，經菌液PCR鑒定為陽性的樣品進行進一步測序，依據測序結果進行比對以確定樣品是否被蕪菁花葉病毒侵染。

3.根據權利要求2所述的一種檢測蕪菁花葉病毒所用PCR引物檢測方法，其特征在于，所述cDNA第一條鏈合成：在RNase-free微量Eppendorf 管中依次加入2μl M4-T(18)，2μlSuper Pure dNTPs（2.5mmol each），3μl RNA，補RNase-Free ddH2O至14.5μl，混勻，70℃溫浴5min；迅速置于冰上靜置2min；加入4μl 5×First-Strand buffer，0.5μl RNase抑制劑（20 U·μL-1），1μl TIANScript M-MLV反轉錄酶（200U·L-1），使用移液槍吹打混合均勻，42℃溫浴50min，反應結束后于95℃下溫浴5min以終止反應，待溫度降至室溫后加入RNase-Free ddH2O稀釋至50ul備用。