[發明專利]一種葡萄籽原花青素的提取方法

有效

• 申請號: 201711424727.2
• 申請日: 2017-12-25
• 公開（公告）號: CN108003128B
• 公開（公告）日: 2020-09-15
• 發明（設計）人: 石清東;王正元;陳赫巖;王姣
• 申請（專利權）人: 北京頤方生物科技有限公司
• 主分類號: C07D311/62
• 分類號: C07D311/62;A61P3/10;A61P39/06;A23L33/105
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;姚自奇

1.一種葡萄籽原花青素的提取方法，包括以下步驟:

1)葡萄籽預處理

選取無霉變的葡萄籽，放入清洗池中，用無菌水清洗3次，瀝干或采用干燥的葡萄籽為原料，將干燥的葡萄籽在無菌水中浸泡2h，使其充分吸水，浸泡清洗后瀝干；將瀝干后的葡萄籽放入滾筒式碾壓機中，使葡萄籽碾壓通過1.0mm的碾壓間隙，經過碾壓機處理后葡萄籽成扁平形狀，種皮被碾出幾道裂縫，清晰可見胚乳滲出；

2)發酵葡萄籽制備

a)菌種活化:將黑曲霉菌種接種于經過無菌驗證的含有土豆培養基的試管斜面或平板中，然后將接種后的斜面或平板在25～30℃條件下培養72h，獲得活化黑曲霉菌種；

b)菌種一級擴培:取500mL的錐形瓶，每瓶加入預處理后的葡萄籽40g和面粉2g，以此作為培養基；將培養基進行濕熱滅菌，滅菌條件為溫度為121℃，時間為15min；當培養基溫度降到25℃時，移至超凈工作臺中，接入活化后的菌種，在25～30℃恒溫箱中培養72h，期間每12h搖動錐形瓶一次，制得一級擴培菌種；

c)菌種二級擴培:取碾壓后的葡萄籽10kg，進行濕熱滅菌，滅菌條件為溫度為121℃，時間為15min，滅菌完成后當葡萄籽的溫度降至25℃時進行接種，接種量為1％，菌種與發酵基質混勻后，平鋪于滅菌過的發酵間進行恒溫發酵，保持室內濕度為85％，共保溫發酵培養48h，每隔12h進行翻拌一次，制得二級擴培菌種；

d)葡萄籽發酵:將預處理后的葡萄籽與菌種按質量比20:1的比例進行接種，翻拌混勻后平鋪于滅菌過的發酵間中進行發酵，在溫度為28℃，濕度為90％的條件下，發酵48h，期間每隔8h進行翻拌一次；

3)原花青素提取液制備

采用三級四罐式逆流提取方式，罐體編號為A、B、C、D，具體操作為，每罐加入發酵后葡萄籽50kg，將乙酸調pH為5.0的80％乙醇溶液200L加入到A罐中，在溫度為75℃條件下攪拌浸提20min，獲得浸提液A1，將A1儲存，將相同量的溶劑加入到A罐中，在相同條件下攪拌浸提20min，獲得浸提液A2；再將浸提液A2抽入到B罐中，在相同的浸提條件下浸提，獲得浸提液B1，將B1儲存，將相同量的溶劑加入到A罐中，在相同的條件下浸提，浸提完成后，獲得浸提液A3和料渣，將料渣從A罐中清除，并向A罐中再加入50kg發酵葡萄籽，再將浸提液A3加入到B罐中，在相同條件下浸提，獲得浸提液B2；將B2加入到C罐中獲得浸提液C1，將C1儲存，將浸提液加入到B罐中浸提，在相同條件下浸提，獲得浸提液B3和料渣，清除B罐中的料渣，并向B罐中加入發酵葡萄籽50kg；將濾液B3加入到C罐中在相同條件下浸提，獲得浸提液C2；將C2加入到D罐中在相同條件下浸提，獲得浸提液D1，將D1儲存，將溶劑加入到C罐中在相同條件下浸提，獲得浸提液C3和料渣，清除C罐中的料渣，并向C罐中加入發酵葡萄籽50kg；將C3提取液加入到D罐中在相同條件下浸提，獲得浸提液D2；將D2加入到A罐中，獲得浸提液A1，將A1儲存，按照上述方式循環進行提取，合并上述存儲的提取液，離心過濾除去絮狀沉淀，獲得無沉淀液提取液；

4)原花青素粗提物

將無沉淀提取液進行減壓蒸餾，條件為:60～80℃，真空度為0.06～0.08MPa，在此條件下蒸餾，回收乙醇，獲得原花青素水溶液，將原花青素水溶液進行噴霧干燥，獲得原花青素粗提取物；

5)原花青素精制

將AB-8大孔樹脂分別用乙醇浸泡24h，用乙醇沖洗至流出液與蒸餾水混合無混濁現象，再用蒸餾水沖洗至流出液無乙醇味，將預處理后的吸附樹脂進行裝柱，層析柱徑高比1:30，要求樹脂均勻分散且無氣泡，稱取原花青素粗產品配制成濃度為2.5％水溶液，過濾除去不溶性雜質，對原花青素溶液進行過柱，用3倍柱體積為30％的乙醇溶液進行解吸，收集洗脫液減壓蒸餾，獲得原花青素水溶液標記為提取組分1，再用3倍柱體積60％的乙醇溶液作為洗脫劑進行解吸，收集洗脫液，減壓蒸餾回收乙醇，獲得原花青素將水溶液標記為提取組分2；

6)低聚原花青素制備

取原花青素水溶液提取組分2加入體積分數為10％的混合酸，混合酸由6％亞硫酸溶液和99.5％冰乙酸體積比0.8:1組成，在70℃條件下保溫60min，用NaOH溶液調pH為6.0，并將原花青素水溶液與提取組分1進行混合，降溫到4℃，低溫濾去不溶物，混合后進行噴霧干燥，干燥條件進口溫度為120℃，出口溫度80℃獲得原花青素提取物。