[發明專利]一種利用SOL技術和化學發光技術對血清miRNA標志物進行定量檢測的方法

在審

• 申請號: 201711423381.4
• 申請日: 2017-12-25
• 公開（公告）號: CN108132241A
• 公開（公告）日: 2018-06-08
• 發明（設計）人: 凌凱;姜紅巖
• 申請（專利權）人: 汕頭大學醫學院;凌凱;姜紅巖;深圳市人民醫院
• 主分類號: G01N21/76
• 分類號: G01N21/76;G01N33/574
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛

本發明涉及一種SOL（短鏈核苷酸連接）技術和化學發光技術對血清miRNA（microRNA）標志物進行定量檢測的方法。所述方法首先對血清樣本進行預處理、固定捕獲序列于酶標板上，然后雜交核酸探針a和b、血清中的目標miRNA，再通過多次清洗可去除錯配和部分互補的miRNA，最后利用信號放大序列和化學發光技術對血清中目標miRNA含量進行檢測。本發明提供的方法無需提取血清中的miRNA且無需擴增目標miRNA，靈敏度高，特異性強，可滿足臨床檢測需求。

技術領域

本發明屬于血液游離核酸標志物檢測方法與技術領域，更具體地，涉及一種利用SOL技術和化學發光技術對血清miRNA標志物進行定量檢測的方法。

背景技術

miRNA(microRNA)是一類內源性、長19至24個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子。它主要通過堿基互補配對與指導蛋白質合成的信使RNA(messager RNA，mRNA)相結合，導致其翻譯受阻或降解，從而參與調控個體發育、細胞凋亡、增殖及分化等生命。由于超過半數的miRNA在基因組上定位于與腫瘤相關的脆弱位點，故異常表達的miRNA與多種腫瘤的發生，分期，轉移和復發有著密切關系。

由于miRNA在不同腫瘤中有其特定的表達模式，因此目前有很多研究將miRNA用于腫瘤的診斷和預后監測的分子標志物、治療靶標及疾病分型的標志物。人體不同組織與細胞產生的miRNA通過與脂蛋白結合或集中于外泌體等細胞外囊泡內的兩種方式進入血液。這兩種方式保證了血液中的miRNA不受溫度、酸堿度、以及核酸酶的影響，在外周血中穩定存在。這使得通過檢測血清/血漿/全血中的miRNA標志物成為當下研究腫瘤的熱點。例如：Chen等(Davoren P A,McNeill R E,Lowery A J,et al.Identification of suitableendogenous control genesfor microRNA gene expression analysis in human breastcancer.[J].BMC Mol Biol,2008,9(1):76)利用PCR技術檢測了臨床血清樣本中的91種miRNA，分析比較后篩選出其中10種miRNA(miR-20a,miR-24,miR-25,miR-145,miR-152,miR-199a-5p,miR-221,miR-222,miR-223,miR-320)作為早期診斷非小細胞肺癌的生物標志物，其靈敏度和特異性達到96.6％和97.2％。越來越多的實驗證據表明，miRNA在腫瘤診斷中有較高的靈敏度與特異性，可以作為腫瘤早期診斷的生物標志物。

但是，一般的熒光定量PCR技術仍然具有一些固有的缺陷，其中主要的缺點是：1、需要提取樣本中的總miRNA；2、需要對提取的miRNA進行逆轉錄；3、由于miRNA的序列較短，需要用polyA加尾法或莖環結構的探針進行檢測，增加了實驗的成本和難度；4、檢測時需要對目標miRNA進行擴增，難以滿足臨床檢測的需要。

因此，開發一種靈敏度高、特異性強，且能滿足臨床檢測需求的新型miRNA檢測技術具有重要的研究意義和應用價值。

發明內容

本發明的目的在于克服現有熒光定量PCR技術操作復雜，無法滿足臨床檢測需求的缺陷，提供一種利用SOL技術和化學發光技術對血清miRNA標志物進行定量檢測的方法。

本發明提供的方法無需提取血清中的miRNA，通過多次清洗可去除錯配和部分互補的miRNA，提高定量檢測方法的檢測特異性；另外，使用化學發光技術放大目標miRNA的信號值，故無需擴增目標miRNA；靈敏度高、特異性強，可滿足臨床檢測需求。

為實現上述發明目的，本發明采用如下技術方案：

一種利用SOL技術和化學發光技術對血清miRNA標志物進行定量檢測的方法，所述方法包括如下步驟：

S1：對臨床采集的血清樣本進行預處理使其中miRNA游離，得血清樣品預處理溶液，備用；