[發明專利]一種利用SOL技術和化學發光技術對血清miRNA標志物進行定量檢測的方法

在審

• 申請號: 201711423381.4
• 申請日: 2017-12-25
• 公開（公告）號: CN108132241A
• 公開（公告）日: 2018-06-08
• 發明（設計）人: 凌凱;姜紅巖
• 申請（專利權）人: 汕頭大學醫學院;凌凱;姜紅巖;深圳市人民醫院
• 主分類號: G01N21/76
• 分類號: G01N21/76;G01N33/574
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛

1.一種利用SOL技術和化學發光技術對血清miRNA標志物進行定量檢測的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

S1：對臨床采集的血清樣本進行預處理使其中miRNA游離，得血清樣品預處理溶液，備用；

S2：向酶標板中加入捕獲序列溶液，震蕩，混合均勻后于25~40℃震蕩，將捕獲序列固定在酶標板上，棄去溶液，除去多余未反應的捕獲序列；所述捕獲序列為NH₂-(CH₂)₁₂-GTTGTAAATTGTAGTAAAGAAGTA；所述酶標板含有可與-NH₂反應的基團；

S3：將S1中的血清樣品預處理溶液、核酸探針a溶液和核酸探針b溶液加入至S2的酶標板中，震蕩，混合均勻后，于40~50℃靜置條件下雜交15~21h，棄去濾液，清洗至少3次；所述核酸探針a為：CAAACAAACATTCAAATATCAATC-與目標miRNA一半序列互補區域；所述核酸探針b為：與目標miRNA另一半序列互補區域-TACTTCTTTACTACAATTTACAAC；

S4：將信號放大序列溶液加入至S3得到的酶標板中，混合均勻后，于40~50℃靜置條件下雜交不低于2h，將信號放大序列與核酸探針b雜交；所述信號放大序列為：GATTGATATTTGAATGTTTGTTG，所述信號放大序列上修飾一個或多個生物素；

S5：向S4得到的酶標板中加入可與生物素反應的親和素-過氧化物酶融合蛋白溶液，震蕩混合均勻后，通過生物素-親和素反應將親和素-過氧化物酶融合蛋白雜交在所述信號放大序列上；

S6：向酶標板上加入可與過氧化物酶反應的化學發光底物進行化學發光檢測，通過標準曲線即可得到miRNA的含量。

2.根據權利要求1所述方法，其特征在于，S1中預處理為：將血液樣品溶液與血清預處理液混合，于25~100℃下震蕩反應60~120min；所述血清預處理液為Tween 20-TE緩沖液與Proteinase K的混合溶液，所述血清處理液與血清樣品溶液的體積比不小于1:1。

3.根據權利要求2所述方法，其特征在于，所述TE緩沖液的pH為8.0；所述血清預處理液中Tween 20的質量濃度不低于為1%；所述Proteinase K的濃度不低于為200 μg/ml。

4.根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述捕獲序列通過酰胺反應固定在酶標板上。

5.根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述捕獲序列溶液為捕獲序列PBS緩沖液，所述捕獲序列的濃度不低于1nM。

6.根據權利要求1所述方法，其特征在于，S3中核酸探針a溶液為核酸探針a TE緩沖液，核酸探針b溶液為核酸探針b TE緩沖液；所述緩沖液的pH為7~8，所述核酸探針a和b的濃度均不低于1nM。

7.根據權利要求1所述方法，其特征在于，S3中雜交時間為21h。

8.根據權利要求1所述方法，其特征在于，S4中信號放大序列上修飾的生物素的數量為1~4個。

9.根據權利要求1所述方法，其特征在于，S5中的親和素-過氧化物酶融合蛋白為聯霉親和素-辣根過氧化物酶融合蛋白或親和素-辣根過氧化物酶融合蛋白。

10.根據權利要求1所述方法，其特征在于，S6中化學發光底物為魯米諾、異魯米諾及其衍生物類與雙氧水溶液中的一種或幾種。