[發明專利]一種工業化生產凝乳酶的方法

在審

• 申請號: 201711422200.6
• 申請日: 2017-12-25
• 公開（公告）號: CN107881162A
• 公開（公告）日: 2018-04-06
• 發明（設計）人: 許建立;洪振農
• 申請（專利權）人: 中諾生物科技發展江蘇有限公司
• 主分類號: C12N9/52
• 分類號: C12N9/52;C12N1/20;C12R1/19
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙)11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種工業化生產凝乳酶的方法，其特征在于，該方法的步驟是：

S1、以來源于大腸桿菌K-12的發酵菌株為原始菌株；

S2、傳代菌株制備：將原始菌株劃線在固體平板上，28-30℃恒溫培養箱用固定平板培養基培養24-30小時；

S3、活化液培養：從平板內挑選單菌落分別接入準備好的三角瓶中，用活化培養基培養，28-30℃、180rpm搖床，16-24小時；

S4、種子培養：從活化液中挑選長勢較好的菌落轉接到大瓶培養，擴大種量，接種量按照1％-2％接種,用種子培養基培養，28-30℃、180rpm搖床培養，活化轉接要求OD值為2-5，培養時間8-12h；

S4、發酵種子培養，用飽和蒸汽對發酵種子培養基進行滅菌消毒，降溫到35-38℃，接種量按照1％-2％接種，開啟攪拌220rpm，調節通氣量1:1VVM，氫氧化鈉調節PH值控制在6.7-7.5，培養時間8-12h，控制OD值在2-5轉接；

S5、發酵培養：按照接種量1％-1.5％接入發酵培養基中，在36-37℃，開啟攪拌,通氣量按照溶氧條件調節，培養18-24小時；

S6、發酵結束，檢測菌體含量、濕重、OD值，放料離心處理，收集得到濕菌體，并計重；

S7、濕菌體MEDT溶解，再用EDTA緩沖液清洗菌體，然后離心收集菌體，計重后用EDTA溶解成懸浮液；

S8、菌體懸浮液在800-1000Bar高壓均質機破碎2次以上，檢測OD值在50-65左右時，再次離心收集包涵體；

S9、包涵體經過復性，得到粗制凝乳酶液；

S10、粗制凝乳酶液經過膜過濾、加水洗脫，微濾除雜、超濾濃縮、除菌過濾得到無菌液態產品；

S11、根據客戶需求用無菌水配制要求的酶活。

2.如權利要求1所述工業化生產凝乳酶的方法，其特征在于，，所述發酵培養的具體步驟為：

S5.1、配置發酵培養基，用飽和蒸汽120-122℃滅菌，然后降溫到37℃備用；

S5.2、按照接種量1％-1.5％將凝乳酶種子移種發酵培養基中，在36-37℃下開啟攪拌，起始通氣量500(1:1vvm)M³/h,利用氫氧化鈉和鹽酸控制PH值在6.7-7.5左右，罐壓0.02-0.05Mpa,培養時間4-5h；

S5.3、培養期間檢測OD、濕重、氨基氮、甘油含量指標，當OD超過12、濕重超過20g/L時，開始流加二次補料培養基，二次補料培養基與發酵培養基的質量比為10：100；

S5.4、在培養5h-6h時，隨二次補料培養基同時流加乳糖補料，流加量為50kg/h，乳糖與與發酵培養基的質量比為10：100；

S5.5、當濕重指標50以上時，一次性加入誘導劑IPTG，開始誘導產酶，誘導劑與發酵液的體積為0.3：1000；

S5.6、當濕重不在增長時中止發酵。

3.如權利要求1所述工業化生產凝乳酶的方法，其特征在于，所述固體平板培養基組成為：1％蛋白胨、0.5％酵母粉、1％氯化鈉、1.5％瓊脂、0.1‰氨芐青霉素，其余為水。

4.如權利要求1所述工業化生產凝乳酶的方法，其特征在于，所述活化培養基的組成為：1％蛋白胨、0.5％酵母粉、1％氯化鈉、0.1‰氨芐青霉素，其余為水。

5.如權利要求1所述工業化生產凝乳酶的方法，其特征在于，所述種子培養基的組成為：1％蛋白胨、0.5％酵母粉、1％氯化鈉、0.1‰氨芐青霉素，其余為水。

6.如權利要求1所述工業化生產凝乳酶的方法，其特征在于，所述發酵種子培養基的組成為：1％蛋白胨、0.5％酵母粉、1％氯化鈉、0.1‰氨芐青霉素，其余為水。

7.如權利要求1或2所述工業化生產凝乳酶的方法，其特征在于，所述發酵培養基組成為：3.08％酵母粉、1.54％蛋白胨、2.35‰氯化銨、1％氯化鈉、0.3‰消泡劑、0.1‰氨芐青霉素，0.165‰鹽酸硫銨、0.157‰微量元素、4％甘油，其余為水。

8.如權利要求1所述工業化生產凝乳酶的方法，其特征在于，所述二次補料培養基組成為：10％蛋白胨、20％酵母粉、1.2％氯化銨、10％葡萄糖、0.1％微量元素、其余為水。

9.如權利要求7或8所述工業化生產凝乳酶的方法，其特征在于，所述微量元素由硼酸、氯化鎂、鉬酸鈉、氯化錳、氯化鋁、硫酸、氯化鐵、氯化鈷、氯化鈣、氯化鋅、VB、氯化銅、亞硒酸鈉和生活飲用水配制而成，硼酸、氯化鎂、鉬酸鈉、氯化錳、氯化鋁、硫酸、氯化鐵、氯化鈷、氯化鈣、氯化鋅、VB、氯化銅、亞硒酸鈉和生活飲用水的質量比為：74.4：2800：2：160：2：5000：640：10：240：5.4：4：1.4：1.4：1000。