[發明專利]一種提取殘留DNA的方法

在審

• 申請號: 201711421227.3
• 申請日: 2017-12-25
• 公開（公告）號: CN109957561A
• 公開（公告）日: 2019-07-02
• 發明（設計）人: 翟玉貴;朱秀娟
• 申請（專利權）人: 無錫藥明康德生物技術股份有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京奉思知識產權代理有限公司 11464
• 代理人: 吳立;鄒軼鮫

本發明提供了一種快速、有效的從生物制品中提取殘留DNA的方法，包括1)向待提取樣品中加入裂解液以釋放核酸分子，混合并孵育；2)向樣品中加入月桂酰肌氨酸鈉鹽溶液；3)向樣品中加入含有碘化鈉、糖原、異丙醇的混合溶液，并在室溫環境下孵育；4)將樣品離心，除去上清液，收集沉淀。本發明的提取方法步驟簡單，結果重復性好且提取的DNA量準確度更高。

技術領域

本發明涉及一種快速、有效的從生物制品中提取殘留DNA的方法和提取DNA的新型試劑盒。

背景技術

動物細胞來源的CHO細胞株目前作為藥物類蛋白生產的主要宿主細胞之一，其最終產品的雜質含量、安全性都受到嚴格的控制，比如連續傳代宿主細胞系的殘留DNA(rDNA)的含量。動物細胞研究表明，當受試體基因組與rDNA發生不正確嵌合反應，有可能會激活腫瘤基因或者使腫瘤抑制基因失活，從而給受試體的健康帶來極大威脅。雖然在下游純化工藝過程中采用一些去除方法，比如protein A親和色譜、陰/陽離子交換色譜、疏水層析等方法可以顯著去除核酸，但是最終的產品中仍殘留著痕量的DNA。目前FDA嚴格規定其rDNA含量不得超過100pg/支，因此高效、準確的全基因組純化方法和定量方法對藥物是否能滿足其要求顯得非常重要。

對于生物制品中痕量(pg)級的殘留DNA含量進行分析，不但要保證有效去除樣品本身基質的干擾物質，并在多步提取過程中避免環境中的交叉污染，而且要保證本身提取方法的精準回收率、精密度、重復性等(中國藥典2015年版第三部通則9101《藥品質量標準分析方法驗證指導原則》技術指南)。USP<1130>介紹，在提取過程中，使用多種處理方式，如蛋白質進行酶解、化學沉淀、洗滌可以顯著提高DNA的提取回收率。最初在分子生物學研究中，以苯酚-氯仿為基礎的提取方法和以乙醇沉淀為基礎沉淀方法，得到了廣泛應用，但是其遠不能滿足生物工程類藥物低水平殘留DNA的檢測。一些商業化的試劑盒(Wako PureChemical Industries,Ltd.公司的DNA Extractor Kit(Code No.295-50201)、Ivy FineChemicals Corporation公司的DNA Extractor EZ-Kit(Code No.B48202)已獲得推廣，其主要原理是純化過程中DNA發生沉淀反應，高速離心后得到含DNA的白色球珠，之后仍用含乙醇的洗滌液進行進一步的純化處理，已除去細胞代謝、脂等物質，再經過干燥、復融后即得純化DNA液。此種方法需要操作步驟較多，且洗滌步驟容易造成DNA的損失和交叉污染，且洗滌步驟所用到的部分醇類物質仍能造成環境的污染。另外一種廣泛使用的提取方法是磁珠法，如Applied Biosystems公司的PrepSEQTM Nucleic Acid Extraction Kit，提取主要過程為：使用蛋白酶K對樣品進行適當的酶解處理，之后在高鹽環境下向樣品中加入磁珠，在異丙醇存在下、利用“鹽橋作用”使DNA與磁珠表面活性基團發生特異的吸附結合，之后利用磁力架將含DNA的磁珠進行轉移，之后經過一系列的洗滌移除磁珠表面殘留的蛋白降解物質、多糖、細胞代謝物質等，之后用洗脫液從磁珠上面將純化的DNA洗脫之后進行PCR定量分析(User Guide:Applied Biosystems 7500/7500 Fast Real-Time PCR System)。此種提取方法操作步驟繁瑣、所需時間較長、樣品通量較低，且洗滌步驟所用到的部分醇類物質也能造成環境的污染。目前針對兩種方法的商業化試劑盒雖然已廣泛使用，但是除了兩種方法自身的技術缺點之外，對于國內公司來說，兩種試劑盒都存在著貨期較長、采購成本過高的不足。

目前，在樣品提取過程中，為了避免回收率過低或者產生額外的污染，對未知樣品進行已知濃度的DNA加標處理，然后通過加標濃度回收率的數值來評定提取方法的可靠性，目前廣泛接受的標準為：標曲：決定系數(R²)≥0.980，擴增效率：90.0-110.0％，回收率為70.0％-130.0％，RSD％≤30.0％。

發明內容

本發明提供了一種提取核酸的方法，該方法包括：