[發明專利]一種表達人血清白蛋白的基因工程菌及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201711421153.3
• 申請日: 2017-12-25
• 公開（公告）號: CN109957521A
• 公開（公告）日: 2019-07-02
• 發明（設計）人: 謝麗萍;胡又佳;朱文;龔桂花;張偉;韓姝;潘潔
• 申請（專利權）人: 上海醫藥工業研究院;中國醫藥工業研究總院
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12R1/84
• 代理公司: 上海弼興律師事務所 31283
• 代理人: 薛琦;朱水平

本發明公開了一種表達人血清白蛋白的基因工程菌，其是在巴斯德畢赤氏酵母菌(Pichia pastoris)中整合有人血清白蛋白基因的表達載體的工程菌，所述的表達載體依次含有啟動子、α引導肽、人血清白蛋白基因和終止子；所述的基因工程菌具有抗遺傳霉素性能。利用該基因工程菌進行人血清白蛋白的表達時，甲醇誘導96小時后蛋白的產量即可達8.86g/L，生產效率可達92.29mg/L/h；且發酵過程中可無需通入無菌氧氣。因此，本發明中的菌株生產效率明顯更高，能大幅度縮短生產周期，降低時間及人員和設備運作成本，產業化意義較大。

技術領域

本發明涉及生物工程技術領域，具體涉及一種表達人血清白蛋白的基因工程菌及其制備方法和應用。

背景技術

人血清白蛋白(HSA)是人體血漿中最豐富的蛋白質，含量占血清總蛋白的60％，約為35-40g/L，主要功能為維持血漿滲透壓以及各類物質的轉運。HSA廣泛應用于休克及燒傷治療、術后恢復、藥物載體、細胞培養基等，其全世界需求量已達600噸/年左右，中國需求量約占其三分之一。目前，人血清白蛋白主要來自人血提取，相應的純化工藝為低溫乙醇沉淀法，其來源嚴重受到血液供給的限制，存在血液病毒傳播和擴散風險，且純化過程中對大量有機試劑和低溫控制的需求也導致其效率低下。

利用轉基因技術構建工程菌并生產外源蛋白最早起源于上世紀70年代，此后，包括大腸桿菌、釀酒酵母、畢赤酵母、昆蟲、動植物細胞以及動植物等在內的一系列外源蛋白表達系統得以建立和飛速發展，為珍貴的蛋白類藥物以及更高效、更環保的工業酶的產業化應用提供了巨大的推動作用。目前，利用轉基因技術已在多種表達系統中實現了人血清白蛋白的外源表達及相關純化工作，包括大腸桿菌、釀酒酵母、畢赤酵母、動植物細胞以及動植物。

大腸桿菌(Escherichia coli)是一種原核生物，因具有清晰的遺傳背景、簡單的營養要求以及安全性被廣泛應用于外源蛋白的表達。早在1981年Richard等就利用大腸桿菌成功表達HSA，但僅定性檢測出其表達，而產量未知；D.Sleep等于1990年利用釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)成功表達出HSA，但由于釀酒酵母表達系統產量較低，同時此系統會對HSA實施高度糖基化，極易引起免疫原性；武漢大學研究人員Yang He等將轉基因技術應用于傳統農作物水稻，實現了每公斤水稻獲取2.75g高純度HSA的喜人成績。然而轉基因植物的培養周期較長，受環境因素影響大，且易造成轉基因作物的抗性基因擴散；臺灣學者Yu-Kuo Liu等利用轉基因植物離體細胞表達系統，實現了75mg/L 的HSA表達。但總體而言，轉基因動植物細胞表達系統的產量不樂觀，且培養成本較高，故一般不作為HSA產業化生產的首選。