[發(fā)明專利]一種表達人血清白蛋白的基因工程菌及其制備方法和應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201711421153.3
• 申請日: 2017-12-25
• 公開（公告）號: CN109957521A
• 公開（公告）日: 2019-07-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 謝麗萍;胡又佳;朱文;龔桂花;張偉;韓姝;潘潔
• 申請（專利權(quán)）人: 上海醫(yī)藥工業(yè)研究院;中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12R1/84
• 代理公司: 上海弼興律師事務(wù)所 31283
• 代理人: 薛琦;朱水平

1.一種表達人血清白蛋白的基因工程菌，其特征在于，其是在巴斯德畢赤氏酵母菌(Pichia pastoris)中整合有人血清白蛋白基因的表達載體的工程菌，所述的表達載體依次含有啟動子、α引導(dǎo)肽、人血清白蛋白基因和終止子。

2.如權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的啟動子為AOX1啟動子；

所述的α引導(dǎo)肽來源于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；

和/或，所述的表達載體帶有抗遺傳霉素基因，所述的基因工程菌具有抗0.25～5.0mg/mL濃度的遺傳霉素的性能。

3.如權(quán)利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述的人血清白蛋白基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；

和/或，所述的表達載體的骨架為質(zhì)粒pPIC9K。

4.一種表達載體，其特征在于，其依次含有啟動子、α引導(dǎo)肽、人血清白蛋白基因和終止子。

5.如權(quán)利要求4所述的表達載體，其特征在于，所述的啟動子為AOX1啟動子；

所述的α引導(dǎo)肽來源于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；

所述的表達載體的骨架為質(zhì)粒pPIC9K；

所述的表達載體帶有抗性基因；所述抗性基因優(yōu)選遺傳霉素；

和/或，所述人血清白蛋白基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。

6.一種如權(quán)利要求1～3任一項所述的表達人血清白蛋白的基因工程菌的制備方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

(1)構(gòu)建權(quán)利要求4或5所述的表達載體；

(2)將步驟(1)所得表達載體轉(zhuǎn)化至巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)中；

(3)將步驟(2)所得的巴斯德畢赤氏酵母涂布于含有抗性基因篩選標記的抗生素的平板中培養(yǎng)后挑選平板上的轉(zhuǎn)化子即得。

7.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述的轉(zhuǎn)化為電轉(zhuǎn)化，所述電轉(zhuǎn)化的電勢優(yōu)選0.75～1.5Kv/cm，更優(yōu)選1.0Kv/cm；

步驟(3)中所述的抗生素為遺傳霉素，遺傳霉素的濃度為0.25～5.0mg/mL；

步驟(3)中所述的平板為YPD平板；

和/或，步驟(3)中所述培養(yǎng)的條件為22～30℃，培養(yǎng)24～144小時；優(yōu)選28℃，培養(yǎng)96小時。

8.一種人血清白蛋白的制備方法，其特征在于，其包括將權(quán)利要求1～3任一項所述的基因工程菌接種于巴斯德畢赤氏酵母菌培養(yǎng)基中發(fā)酵，從發(fā)酵液中獲得人血清白蛋白即可。

9.如權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)基含有BMGY或者BMMY；所述BMGY或者所述BMMY占搖瓶總體積百分比優(yōu)選10-30％，更優(yōu)選20％。

10.如權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述發(fā)酵的培養(yǎng)的過程中，每12～24小時添加體積分數(shù)為0.5～2.0％的甲醇，添加4～8次；優(yōu)選每12小時添加體積分數(shù)為1.0％的甲醇，添加8次。