[發(fā)明專利]蛋白酶檢測(cè)用電化學(xué)傳感器及制備方法及檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711421008.5
• 申請(qǐng)日: 2017-12-25
• 公開（公告）號(hào): CN107843631B
• 公開（公告）日: 2019-08-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 夏寧;劉林;趙豐;鄧德華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 安陽師范學(xué)院
• 主分類號(hào): G01N27/327
• 分類號(hào): G01N27/327;G01N27/48
• 代理公司: 鄭州立格知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 41126
• 代理人: 田磊;賀保平

蛋白酶檢測(cè)用電化學(xué)傳感器，所述的電化學(xué)傳感器采用在玻碳電極表面修飾一層芘丁標(biāo)記的多肽?石墨烯復(fù)合物，所述的多肽的序列特征是：所述的多肽能夠被對(duì)應(yīng)的蛋白酶切割，切割位點(diǎn)往碳端方向的第三個(gè)氨基酸是組氨酸，第四個(gè)氨基酸是側(cè)鏈上修飾了芘丁基團(tuán)的賴氨酸。蛋白酶檢測(cè)的檢測(cè)方法，包括以下步驟：1：電化學(xué)傳感器的制備，包括以下子步驟：1.1：多肽?石墨烯復(fù)合物的制備：1.2：電化學(xué)傳感器的制備：2：蛋白酶的檢測(cè)。本方法屬于“信號(hào)增強(qiáng)”的高通量電化學(xué)傳感方法，具有背景電流低、抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于蛋白酶檢測(cè)的電化學(xué)傳感器及制備方法及檢測(cè)方法，屬于化學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

蛋白酶能夠水解蛋白質(zhì)或多肽中的肽鍵。它在消化吸收、創(chuàng)口愈合、功能免疫等方面具有決定性作用。一些重大疾病的發(fā)生與蛋白酶的含量和活性變化密切相關(guān)，例如，癌癥、細(xì)胞凋亡、阿爾茨海默病、艾滋病等等。因此，蛋白酶檢測(cè)在這些重大疾病的診斷和治療研究等方面具有重要意義。目前用于檢測(cè)蛋白酶的方法主要有高效液相色譜、凝膠色譜、質(zhì)譜和熒光光譜等，但高效液相色譜、凝膠色譜、質(zhì)譜需要特殊的儀器、靈敏度較低、分析成本較高。熒光光譜法往往需要對(duì)酶基底（通常是多肽）兩端進(jìn)行標(biāo)記、耗時(shí)耗力，此外，多肽兩端被標(biāo)記后有可能會(huì)影響蛋白酶催化切割的效率。介于蛋白切割反應(yīng)在研究生命活動(dòng)及疾病防治中的重大作用，建立一種低成本、簡(jiǎn)單快速、適于在一般實(shí)驗(yàn)室或臨床中監(jiān)控蛋白酶含量或活性變化的方法是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。

電化學(xué)傳感技術(shù)是根據(jù)電化學(xué)原理，將待測(cè)物質(zhì)的濃度變化轉(zhuǎn)化為電信號(hào)變化的一種傳感技術(shù)。該技術(shù)的突出特點(diǎn)在于研究信息在表面上的^“聚焦^”與增強(qiáng)、樣品的需要量極微、分離純化簡(jiǎn)便、靈敏度高、選擇性好等。目前用于蛋白酶檢測(cè)的電化學(xué)傳感器的主要設(shè)計(jì)理念是：將基底多肽的一端修飾上能夠產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)的基團(tuán)（如二茂鐵、亞甲基藍(lán)、酶標(biāo)記物等），用于產(chǎn)生電信號(hào)，另一端修飾上特殊的氨基酸（通常是半胱氨酸），用于將多肽固定到電極表面（通常是金電極）。當(dāng)多肽被蛋白酶切割之后，電信號(hào)基團(tuán)就會(huì)從電極表面脫落，導(dǎo)致電流降低。但是，這類電化學(xué)傳感方法在實(shí)際應(yīng)用中存在的主要問題是：一是電信號(hào)基團(tuán)自身容易降解或變質(zhì)，不利于電極芯片的長(zhǎng)時(shí)間保存；二是這種“信號(hào)衰減”的檢測(cè)模式具有較大的背景電流，靈敏度較低、誤差較大。因此，開發(fā)一種簡(jiǎn)單靈敏、“信號(hào)增強(qiáng)”的高通量電化學(xué)傳感方法，對(duì)于蛋白酶的檢測(cè)和一些重大疾病的監(jiān)控具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服目前的蛋白酶檢測(cè)中存在的上述問題，提供一種蛋白酶檢測(cè)用電化學(xué)傳感器及制備方法及檢測(cè)方法。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，采用了下述的技術(shù)方案：蛋白酶檢測(cè)用電化學(xué)傳感器，所述的電化學(xué)傳感器采用在玻碳電極表面修飾一層芘丁標(biāo)記的多肽-石墨烯復(fù)合物，所述的多肽的序列特征是：所述的多肽能夠被對(duì)應(yīng)的蛋白酶切割，切割位點(diǎn)往碳端方向的第三個(gè)氨基酸是組氨酸，第四個(gè)氨基酸是側(cè)鏈上修飾了芘丁基團(tuán)的賴氨酸。

蛋白酶檢測(cè)用電化學(xué)傳感器的制備方法，包括以下步驟：

A：多肽-石墨烯復(fù)合物的制備：將石墨烯納米片與芘丁標(biāo)記的多肽溶液超聲混合30分鐘，所述的多肽的序列特征是：所述的多肽能夠被對(duì)應(yīng)的蛋白酶切割，且切割位點(diǎn)往碳端方向的第三個(gè)氨基酸是組氨酸，第四個(gè)氨基酸是側(cè)鏈上修飾了芘丁基團(tuán)的賴氨酸，離心棄除上層剩余的多肽，然后用磷酸緩沖溶液將所得到的多肽-石墨烯復(fù)合物離心洗滌3次，于4 ℃下保存?zhèn)溆茫?/p>

B：電化學(xué)傳感器的制備：將步驟A中制備得到的芘丁標(biāo)記的多肽-石墨烯復(fù)合物多用磷酸緩沖溶液震蕩分散，取出5微升混合液滴加到直徑為3 mm的玻碳電極表面，自然晾干，得到電化學(xué)傳感器。

蛋白酶檢測(cè)的檢測(cè)方法，包括以下步驟：

1：電化學(xué)傳感器的制備，包括以下子步驟：