[發(fā)明專利]一種固定化纖維素酶的制備及其酶水解纖維素的方法

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• 申請日: 2017-12-25
• 公開（公告）號: CN108004229A
• 公開（公告）日: 2018-05-08
• 發(fā)明（設計）人: 劉研萍;馬一方;蘭淼;李秀金;袁海榮
• 申請（專利權）人: 北京化工大學
• 主分類號: C12N11/10
• 分類號: C12N11/10;C12N11/08;C12N11/04
• 代理公司: 北京思海天達知識產(chǎn)權代理有限公司 11203
• 代理人: 劉萍

本發(fā)明提供了一種固定化纖維素酶的制備及其酶水解纖維素的方法。制備固定化纖維素酶的方法為交聯(lián)包埋法，以海藻酸鈉為載體，利用海藻酸鈉中OH?和COOH?的氧原子與Ca2+發(fā)生離子交換反應的原理形成凝膠，戊二醛為交聯(lián)劑，聚乙二醇為致孔劑和親水劑，加入聚乙二醇可以提高固定化纖維素酶的酶活固定率和酶活力、降低米氏常數(shù)、提高載體表面的孔密度，增加酶水解反應的還原糖含量、酶水解得率和TS降解率。在固定化酶水解纖維素的過程中，可以實現(xiàn)纖維素酶的多次循環(huán)利用。本發(fā)明的制備及應用方法操作簡便、固定條件溫和、投資低、對環(huán)境友好。

技術領域

本發(fā)明具體涉及到一種固定化纖維素酶的制備方法，以及固定化纖維素酶用于纖維素水解的方法。

背景技術

纖維素是自然界中分布最廣、儲量最大的天然高分子，是構成細胞壁的基礎物質(zhì)。每年植物通過光合作用產(chǎn)生數(shù)千億噸的纖維素，是一種取之不用之不竭的可再生資源。近年來，隨著煤、石油、天然氣等不可再生資源的逐步枯竭以及環(huán)境問題的日益嚴重，有關纖維素作為可再生資源的利用研究成為當今國際科學研究的前沿領域之一。

纖維素是由β-D-吡喃葡萄糖以(1-4)-β-糖苷鍵聯(lián)結而成的長鏈不分支的均質(zhì)多糖。分子鏈具有C1椅式構象。單體上的3個羥基分別位于葡萄糖環(huán)單元上的2、3、6碳原子上，其中C-2、C-3、C-6位置上分別是仲醇羥基、仲醇羥基和伯醇羥基。由于自身具有較高的結晶度、分子間和分子內(nèi)存在很好的氫鍵，天然纖維素不能熔融，也很難溶于常規(guī)溶劑，這極大地限制了纖維素的開發(fā)和利用。

纖維素在生物轉化過程中，纖維素酶可將其水解為易于利用的可溶性小分子還原糖，以實現(xiàn)木質(zhì)纖維素的高效利用。纖維素酶作為催化劑，理論上可以多次用于酶水解反應中。纖維素酶是水溶性制劑，在酶水解纖維素的過程中，會與產(chǎn)物融合在一起，一方面造成纖維素酶的流失，另一方面使產(chǎn)物的純度降低。纖維素酶價格昂貴，其循環(huán)多次利用及提高產(chǎn)物純度是酶水解工藝需解決的主要問題。

纖維素酶的固定化是實現(xiàn)纖維素酶多次循環(huán)使用的有效方法。文獻：陳偉兵.海藻酸鈉/SiO2復合水凝膠的制備及作為固定化纖維素酶載體的研究[D].華僑大學.文中研究表明，以海藻酸鈉為主要載體，經(jīng)NHS和EDC活化海藻酸鈉上的羧基后，以KH-550偶聯(lián)劑，加入纖維素酶將其固定。但是，由于酶分子經(jīng)過固定后運動受限，從而使得與底物之間的空間位阻增加。固定化酶的米氏常數(shù)增高，與游離酶相比，由0.122mg/ml增高至1.10mg/ml，增加了8倍。米氏常數(shù)的增高表明酶分子其與底物的親和力降低，這不利于纖維素酶發(fā)揮其有效的水解作用。

發(fā)明內(nèi)容

為進一步解決以上問題，本發(fā)明的目的在于，提供一種纖維素酶的固定方法，提高酶分子與底物的親和力，并將其用于酶水解反應中，實現(xiàn)纖維素酶的循環(huán)利用。

本發(fā)明采用交聯(lián)包埋法作為纖維素酶的固定方式。為了提高底物與酶分子之間的親和力、減少空間阻力，在以海藻酸鈉為固定化纖維素酶的載體、戊二醛為交聯(lián)劑的基礎上，加入聚乙二醇；聚乙二醇一方面作為致孔劑，另一方面提高固定化酶的親水性；交聯(lián)后的纖維素酶加入到氯化鈣溶液中形成凝膠。反應原理為：戊二醛的醛基可以與纖維素酶的氨基發(fā)生希夫氏堿交聯(lián)反應使酶分子相互交聯(lián)；海藻酸鈉G單元OH-和COO-的氧原子與Ca2+發(fā)生離子交換反應形成“Egg-box”結構，將酶分子固定；聚乙二醇在海藻酸鈉-Ca2+固定體系中部分溶出，在載體表面形成均勻的孔結構，減少傳質(zhì)阻力；同時其含有的羥基和聚乙二醇基與載體和纖維素酶分別形成氫鍵，增加親水性。

采用以上方法制備出的固定化纖維素酶，用于纖維素的酶水解反應，水解效果較未添加聚乙二醇相比，得到顯著地提高。

具體步驟如下：