[發(fā)明專利]單核細(xì)胞增生李斯特菌LLO膠體金的制備及初步應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711414515.6
• 申請日: 2017-12-25
• 公開（公告）號: CN108226491B
• 公開（公告）日: 2020-10-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 江玲麗;高有領(lǐng);胡興娟;楊立鋒;俞錚錚
• 申請（專利權(quán)）人: 寧波衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/558
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明提供單核細(xì)胞增生李斯特菌LLO膠體金的制備及初步應(yīng)用，抗單核細(xì)胞增生李斯特菌單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，解決了可靠的LM單克隆抗體不易獲得的問題，經(jīng)多年多次傳代，能穩(wěn)定分泌單克隆抗體，它分泌的單克隆抗體，應(yīng)用于膠體金法檢測食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，具有良好的靈敏性、特異性、穩(wěn)定性和可重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)。病原在濃度很低的情況下也能被檢出，進(jìn)一步提高檢測靈敏度和檢出率，嚴(yán)防漏檢和誤檢。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，確切地說是單核細(xì)胞增生李斯特菌LLO膠體金的制備及初步應(yīng)用。

背景技術(shù)

單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，LM)是最常見的食源性致病菌之一，WHO將其與大腸桿菌O157:H7、沙門氏菌以及金黃色葡萄球菌并列為20世紀(jì)90年代四大食源性致病菌。LM是李斯特菌屬中致病力最強(qiáng)的細(xì)菌，也是唯一對人致病的、典型的胞內(nèi)寄生菌，可穿越宿主三道屏障，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的人畜共患傳染病，如胃腸炎、腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)等。孕婦、新生兒、老年人以及免疫功能缺陷者感染該菌后致死率達(dá)20-30％，新生兒等免疫力低下者的致死率高達(dá)70％。牛、馬、羊、兔、雞、豬等畜禽感染該菌后會造成嚴(yán)重的腦膜炎、壞死性心肌炎及壞死性肝炎，致死率為52-100％。近年來，食品感染LM而引起的召回或銷毀事件也不斷發(fā)生，給食品行業(yè)和國民經(jīng)濟(jì)造成了重大損失，已報道的2011年期間全球范圍內(nèi)的食品召回事件高達(dá)17起。為此在三十三屆食品法典委員會會議上專門設(shè)立了《食品中產(chǎn)單核李斯特菌控制守則》等三個議題，許多國家將LM列為嚴(yán)重的食品污染菌和零檢出項(xiàng)目。目前，我國對LM的檢測主要采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)檢測及鑒定、PCR、ELISA和全自動鑒定系統(tǒng)等檢測技術(shù)，傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)與生化鑒定一般需要3-7天，檢測周期長，操作繁瑣；PCR技術(shù)需要提取核酸后進(jìn)行擴(kuò)增，DNA提取過程中易受到外源核酸的影響，同時食品中的雜質(zhì)和雜菌均會抑制PCR擴(kuò)增，造成假陰性的出現(xiàn)；國內(nèi)市場沒有專門針對LM的ELISA試劑盒，所以LM的ELISA檢測均需購買國外進(jìn)口試劑盒，這無疑增加了檢測成本，限制了ELISA的廣泛應(yīng)用；全自動鑒定系統(tǒng)價格高昂，很難在基層實(shí)驗(yàn)室普及。而且以上檢測都存在一個共同的問題——在實(shí)際樣品的實(shí)測中，均需要對食品進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，以期通過增菌過程來提高LM的數(shù)量，但這樣無疑延長了檢測時間，不適合食源性致病菌的快速檢測。針對這一實(shí)際情況，建立一套專門針對食品中微量LM的靈敏、準(zhǔn)確、特異、快速的檢測技術(shù)，以保證病原在濃度很低的情況下也能被檢出，進(jìn)一步提高檢測靈敏度和檢出率，嚴(yán)防漏檢和誤檢，是食品中微量致病菌檢測亟待解決的問題之一。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了提高檢測食品中微量LM的靈敏性、準(zhǔn)確性、特異性問題，而提供單核細(xì)胞增生李斯特菌LLO膠體金的制備及初步應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

單核細(xì)胞增生李斯特菌LLO膠體金的制備及初步應(yīng)用，包括如下步驟：

步驟(1)LLO的表達(dá)及純化：

步驟(1.1)hly基因的擴(kuò)增與克隆：

根據(jù)GenBank公布的標(biāo)準(zhǔn)菌株EGDehly基因序列(GenBank:M18970.1)，通過VectorNTI軟件設(shè)計(jì)引物對hly-a/hly-b(hly-a-NdeI：hly-b-XhoI：)(擴(kuò)增片段1533bp)，并在引物的5’端分別引入NdeI和XhoI的酶切位點(diǎn)(下劃線斜體部分)；用高保真聚合酶KODPlusNeopolymerase擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)菌株EGDe的hly基因片段，經(jīng)割膠回收純化后，通過引入的限制性內(nèi)切酶NdeI/XhoI，將hly片段連接至原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a中，轉(zhuǎn)化入表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞Rosetta中；重組質(zhì)粒pET-30a-hly的鑒定采用靶基因hly的PCR擴(kuò)增及NdeI/XhoI雙酶切鑒定，同時送往北京華大基因科技股份有限公司測序，以確保無移碼突變；

步驟(1.2)可溶性LLO的低溫誘導(dǎo)表達(dá)及純化：