[發明專利]單核細胞增生李斯特菌LLO膠體金的制備及初步應用

有效

• 申請號: 201711414515.6
• 申請日: 2017-12-25
• 公開（公告）號: CN108226491B
• 公開（公告）日: 2020-10-27
• 發明（設計）人: 江玲麗;高有領;胡興娟;楊立鋒;俞錚錚
• 申請（專利權）人: 寧波衛生職業技術學院
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/558
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.單核細胞增生李斯特菌LLO膠體金的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟(1)LLO的表達及純化：

步驟(1.1)hly基因的擴增與克隆：

根據GenBank公布的標準菌株EGDehly基因序列，通過VectorNTI軟件設計引物對hly-a/hly-b(hly-a-NdeI：5’-ACTCATATGAAGGATGCATCTGCATTCAAT-3’；hly-b-XhoI：5’-TTACTCGAGTTCGATTGGATTATCTACTTTAT-3’，并在引物的5’端分別引入NdeI和XhoI的酶切位點；用高保真聚合酶KOD Plus Neo polymerase擴增標準菌株EGDe的hly基因片段，經割膠回收純化后，通過引入的限制性內切酶NdeI/XhoI，將hly片段連接至原核表達質粒pET30a中，轉化入表達感受態細胞Rosetta中；重組質粒pET-30a-hly的鑒定采用靶基因hly的PCR擴增及NdeI/XhoI雙酶切鑒定，同時送往測序，以確保無移碼突變；

步驟(1.2)可溶性LLO的低溫誘導表達及純化：

將測序正確的陽性菌液接入含有卡那霉素的LB液體培養基中，37℃振蕩培養至OD₆₀₀為0.6時，加入IPTG16℃誘導表達5h，將誘導條件下表達的菌液經超聲波裂解，分離上清與沉淀并進行SDS-PAGE分析；經鎳螯合層析柱純化獲得目的蛋白，SDS-PAGE電泳分析其純度，利用BCA法測定濃度后加甘油分裝，-20℃備用；

步驟(2)抗LLO單克隆抗體的制備及純化：

根據免疫程序，利用純化后的重組His-LLO免疫6周齡Balb/c小鼠4次后，取血清抗體效價最高小鼠的脾細胞與雜交瘤細胞進行細胞融合，先后用含HAT和HT的細胞培養基對融合后的細胞進行篩選；間接ELISA檢測雜交瘤細胞上清篩選陽性雜交瘤細胞，以His-LLO作為抗原，以雜交瘤細胞上清作為一抗，以羊抗鼠IgG-HRP作為二抗進行間接ELISA，選出特異性高、敏感性好、細胞生長旺盛的陽性孔有限稀釋；3-5次亞克隆后，將陽性單克隆細胞株擴大培養注入石蠟提前致敏的小鼠腹腔，制備腹水，Protien A/G抗體純化柱純化，SDS-PAGE對純化效果進行分析，經細胞融合與克隆篩選，共獲得5株LLO單克隆抗體雜交瘤細胞，分別為1D2D8、4G12C3、6D11F10、8C8B9和9F1C5；

同時取細胞培養上清液，利用單克隆抗體亞型鑒定試劑盒鑒定LLO單克隆抗體的免疫球蛋白類型及亞型；

步驟(3)單克隆抗體的鑒定：

步驟(3.1)單克隆抗體效價及親和力常數的測定：

采用間接ELISA方法測定腹水抗體效價；同時進行LLO單克隆抗體親和力常數測定，用2.5和1.25μg/mL的LLO進行包被，倍比稀釋已知濃度的單克隆抗體進行間接ELISA測定，酶標儀讀波長為450nm處的OD值，將平臺期的OD₄₅₀值記為100％，并根據公式計算單克隆抗體親和力常數：

Ka＝(n-1)/2(n*Ab₁-Ab₂)，n＝Ag₂/Ag₁

式中：Ag₁、Ag₂為兩個不同的抗原包被質量濃度；Ab₁、Ab₂為相應抗原包被濃度下OD₄₅₀值為平臺期一半時的對應的抗體摩爾濃度；

步驟(3.2)單克隆抗體特異性的測定

應用Western blot對高親和力單克隆抗體進行特異性鑒定，將LLO單克隆抗體分別與純化LLO蛋白、產LLO的單增李斯特菌細菌培養上清液以及其他非單增李斯特菌菌株培養液SDS-PAGE，轉膜后分別以腹水抗體作用來鑒定單克隆抗體與LLO的反應特異性；

步驟(4)膠體金試紙的研制：

步驟(4.1)膠體金探針的制備：

采用檸檬酸鈉還原法制備膠體金，以LLO單克隆抗體標記膠體金，采用差速離心法純化膠體金探針；

步驟(4.2)試紙的準備：

分別以LLO單克隆抗體雜交瘤細胞1D2D8和4D12C3產生的單克隆抗體及羊抗鼠IgG抗體作為試紙的檢測線和質控線，包被硝酸纖維素，組裝膠體金試紙條；

步驟(4.3)特異性試驗：

利用實驗室保存的單增李斯特菌菌株、金黃色葡萄球菌菌株、豬鏈球菌2型菌株革蘭氏陽性菌進行膠體金試紙條的特異性試驗，同時設PBS和培養基BHI陰性對照組；

步驟(4.4)敏感性試驗：

調整單增李斯特菌M7過夜細菌培養液濃度為2.0×10⁹CFU/mL，采用無菌PBS進行10倍梯度稀釋，分別為2.0x 10⁸、2.0x 10⁷、2.0x 10⁶、2.0x 10⁵、2.0x 10⁴及2.0x 10³CFU/mL，分別經12000rpm離心10min后，取上清液，依次LLO膠體金的敏感性試驗；

步驟(4.5)重復性試驗：

取單增李斯特菌分離株M7純過夜培養物，調整細菌濃度為3.0x10⁹CFU/mL,每隔一周檢測1次，共檢測8次，進行LLO膠體金試劑條的重復性試驗，同時設立培養基BHI陰性對照組；

步驟(4.6)穩定性試驗：

將試紙條用塑料袋及鋁箔密封，加干燥劑于4℃保存，每隔1周檢測1次，檢測其穩定性，共檢測10次，同時設立培養基BHI陰性對照組；

步驟(4.7)人工模擬樣品試驗：

取市售冷凍蝦仁、青占魚各1g，加入8mL滅菌PBS，再加入1mL濃度為3.0x10⁹CFU/mL、3.0x10⁸CFU/mL、3.0x10⁷CFU/mL、3.0x10⁶CFU/mL、3.0x10⁵CFU/mL和3.0x10⁴CFU/mL的單增李斯特菌M7滅活菌懸液，充分振蕩混勻后檢測。