[發明專利]一種脂多糖誘導仔豬肝臟細胞程序性壞死模型的建立方法

在審

• 申請號: 201711414135.2
• 申請日: 2017-12-22
• 公開（公告）號: CN107926860A
• 公開（公告）日: 2018-04-20
• 發明（設計）人: 劉玉蘭;康萍;汪龍梅;朱惠玲;王秀英
• 申請（專利權）人: 武漢輕工大學
• 主分類號: A01K67/027
• 分類號: A01K67/027
• 代理公司: 深圳市世紀恒程知識產權代理事務所44287
• 代理人: 胡海國

技術領域

本發明涉及細胞程序性壞死研究技術領域，特別涉及一種脂多糖誘導仔豬肝臟細胞程序性壞死模型的建立方法。

背景技術

細胞程序性壞死是一種由死亡受體介導的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)非依賴性細胞死亡模式，通常在凋亡被抑制的情況下發生，死亡細胞具有明顯的壞死特征。研究表明，細胞程序性壞死在缺血再灌注和炎癥反應等多種因素導致的組織(如肝臟)損傷或壞死中發揮重要作用，有效抑制細胞程序性壞死對這些因素誘導的組織損傷或壞死具有重要的預防和治療作用。

目前常用于誘導細胞程序性壞死的誘導劑包括融合蛋白、病毒轉染系統和黍子籽粒蛋白，但是其中涉及復雜的誘導劑制備過程，包括構建載體、轉染、誘導等許多步驟，以及涉及脫鹽、陽離子交換層析和凝膠層析等繁瑣步驟獲得純化蛋白的制備過程，因此，利用此類誘導劑構建細胞程序性壞死模型存在步驟繁瑣的缺點。

發明內容

本發明的主要目的是提出一種脂多糖誘導仔豬肝臟細胞程序性壞死模型的建立方法，旨在成功建立肝臟細胞程序性壞死模型，且建立方法簡單、效果穩定可靠。

為實現上述目的，本發明提出一種脂多糖誘導仔豬肝臟細胞程序性壞死模型的建立方法，包括如下步驟：

對試驗仔豬進行脂多糖誘導處理，得到待測仔豬；

從待測仔豬的前腔靜脈采血并分離血清，測定血清中的生化指標，判斷脂多糖誘導對仔豬肝臟功能的影響；

取待測仔豬的肝臟樣品，觀察肝臟組織的形態結構和肝細胞的超微結構，并測定肝臟細胞程序性壞死關鍵基因及其蛋白表達，分析脂多糖誘導對仔豬肝臟細胞程序性壞死的作用。

優選地，對試驗仔豬進行脂多糖誘導處理，得到待測仔豬的步驟中：所述脂多糖為大腸桿菌血清型脂多糖，純度大于99％，誘導處理的方式為腹膜注射。

優選地，所述大腸桿菌血清型脂多糖的注射量為仔豬每公斤體重注射80～150μg，誘導時長為2～24h。

優選地，對試驗仔豬進行脂多糖誘導處理，得到待測仔豬的步驟之前，還包括：

將試驗仔豬飼養在飼養籠中，試驗仔豬于22～25℃溫度條件下自由采食飲水10天；

其中，在對仔豬進行誘導處理前10～13h停止供料。

優選地，所述試驗仔豬為34～36日齡的斷奶仔豬，體重為8.7～9.1kg。

優選地，從待測仔豬的前腔靜脈采血并分離血清，測定血清中的生化指標，判斷脂多糖誘導對仔豬肝臟功能的影響的步驟，具體包括：

用促凝真空管從待測仔豬的前腔靜脈采血，然后通過離心分離得到血清，利用生化分析儀測定血清中的生化指標，判斷脂多糖誘導對仔豬肝臟功能的影響；

其中，生化指標包括血清中谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、堿性磷酸酶以及谷氨酰轉肽酶的活性。

優選地，取待測仔豬的肝臟樣品，觀察肝臟組織的形態結構和肝細胞的超微結構，并測定肝臟細胞程序性壞死關鍵基因及其蛋白表達，分析脂多糖誘導對仔豬肝臟細胞程序性壞死的作用的步驟，具體包括：

對采血后的待測仔豬進行戊巴比妥鈉肌肉注射，使待測仔豬完全麻醉后屠宰并取出肝臟；

將肝臟放置于冰上，并用生理鹽水沖掉肝臟上的血跡，然后切取肝臟樣品，用于肝臟組織的形態結構和肝細胞的超微結構觀察，取部分剩余肝臟剪碎后，用于肝臟細胞程序性壞死關鍵基因及其蛋白表達的測定，根據觀測結果分析脂多糖誘導對仔豬肝臟細胞程序性壞死的作用；

其中，所述肝臟細胞程序性壞死關鍵基因包括受體相互作用蛋白1、受體相互作用蛋白3、混合系列蛋白激酶結構域樣蛋白以及磷酸甘油酸變位酶5。

本發明提供的技術方案中，以脂多糖為誘導劑，以肝臟細胞作為細胞程序性壞死模型的模型細胞，并以仔豬作為建模對象，成功建立了肝臟細胞程序性壞死模型，操作方法簡便易行；通過測定肝臟細胞程序性壞死的關鍵基因及蛋白表達，具有測定結果可靠且重復性好的優點。

附圖說明

為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅為本發明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他相關的附圖。

圖1為本發明實施例2中對照組的肝臟組織的形態結構觀察結果圖；

圖2為本發明實施例2中處理組的肝臟組織的形態結構觀察結果圖；