[發(fā)明專利]一種高產(chǎn)莫納克林K的紅曲菌株培育方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711413423.6
• 申請日: 2017-12-22
• 公開（公告）號: CN108165497A
• 公開（公告）日: 2018-06-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 呂玲
• 申請（專利權(quán)）人: 呂玲
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12N15/01;C12R1/645
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明公開一種高產(chǎn)莫納克林K的紅曲菌株培育方法，首先通過對紅曲米進(jìn)行分離純化得到紅曲霉菌落，并將制得的紅曲霉菌落添加到由瓊脂、土豆汁、麥芽汁、乳酸、無水乙醇、硝酸鈉和磷酸二氫鉀制得的培養(yǎng)基中，制得紅曲霉孢子，然后通過氯化鈉無菌水對培養(yǎng)基進(jìn)行沖洗，得到紅曲霉孢子菌懸液，將紅曲霉孢子菌懸液通過紫外線照射進(jìn)行物理誘變后，再添加硫酸二乙酯溶液進(jìn)一步誘變，最后將得到的紅曲霉孢子菌懸液與大米粉混合，使得紅曲菌株快速繁殖；本申請通過原子能輻射誘變的方法結(jié)合高溫打堆的培育方法，有效提高了培養(yǎng)基中紅曲菌株的繁殖速率，紅曲菌株增多，代謝的莫納克林K也遞增，進(jìn)而提高莫納克林K的產(chǎn)量。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)莫納克林K的紅曲菌株培育方法。

背景技術(shù)

生物制藥是十二五規(guī)劃期間國家重點(diǎn)鼓勵發(fā)展的產(chǎn)業(yè)。當(dāng)前癌癥已成為威脅全球人類健康的一大殺手，主要治療手段以西醫(yī)方法為主，包括手術(shù)、放療化療等等，均具有較強(qiáng)的副作用。然而到現(xiàn)在為止，癌癥依然只能靠藥物控制，而新研發(fā)的抗癌功能性紅曲產(chǎn)品與以往的抗癌類藥物相比較，能在體內(nèi)維持較高的血藥濃度，從而提高抗癌活性。并且沒有任何藥物毒性，給藥方便，只需口服給藥，患者無需住院，提高了生活質(zhì)量。抗癌功能性紅曲具有顯著的療效，是一種安全、有效、天然、綠色、零毒的口服抗癌藥物。

但是，目前紅曲霉的發(fā)酵工藝主要有兩種，即固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵。目前紅曲霉生產(chǎn)在固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵兩種方式上常用物理誘變和化學(xué)誘變，進(jìn)而達(dá)到紅曲菌株生產(chǎn)，現(xiàn)有的誘變方式雖然能夠提高菌株產(chǎn)量，但是在原有的產(chǎn)量上增產(chǎn)量小，無法達(dá)到現(xiàn)有市場需求的數(shù)量，另外由于紅曲菌株的產(chǎn)量不高，因此莫納克林K的產(chǎn)量較低。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明目的是提供一種通過原子能輻射誘變的方法結(jié)合高溫打堆的培育方法，可有效提高培養(yǎng)基中紅曲菌株的產(chǎn)量，進(jìn)而提高紅曲菌株中莫納克林K產(chǎn)量的紅曲菌株培育方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是：

一種高產(chǎn)莫納克林K的紅曲菌株培育方法，包括以下步驟：

1)紅曲霉菌種的制備，包括以下具體步驟：A、分離純化，先將紅曲米與蒸餾水按比例3∶1混合，并經(jīng)過研磨機(jī)制得米漿，然后通過過濾器過濾得到菌懸液，備用；B、取具體步驟A中制得的菌懸液滴到由大豆汁制得的紅曲增殖培養(yǎng)基中，于30℃的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)5-7天，再按10％的接種量進(jìn)行第二次增殖培養(yǎng)5-7天，選取純化后的紅曲霉菌株，若不純即可再次按10％的接種量進(jìn)行第三次增殖培養(yǎng)5-7天，依次類推，直至分離得到純化的紅曲霉菌株，備用。

2)紅曲霉菌落的斜面培養(yǎng)，其具體步驟為：A、培養(yǎng)基的制備，取瓊脂13g、土豆汁450mL、麥芽汁450mL、乳酸7mL、無水乙醇100mL、硝酸鈉200mL和磷酸二氫鉀200mL添加到培養(yǎng)皿中，并與蒸餾水按2∶1混合，通過攪拌棒攪拌均勻，同時在攪拌的過程中，添加氯化鈣用于將培養(yǎng)基的PH值調(diào)整至4.0，然后將制得的培養(yǎng)基置于殺菌鍋內(nèi)，在121℃的高溫以及0.1MPa下滅菌20-25min，然后密封取出，置于30℃的恒溫箱內(nèi)發(fā)酵培養(yǎng)8-10天，制得用于接種的培養(yǎng)基，備用；B、紅曲霉菌落接種，取步驟1)制得紅曲霉菌落中的菌絲接入具體步驟A制得的培養(yǎng)基內(nèi)，使得紅曲霉菌絲在培養(yǎng)基內(nèi)生長出紅曲霉孢子，備用；

3)紅曲霉誘變出發(fā)菌株及篩選，其具體步驟為：A、取20mL0.8％氯化鈉無菌水從步驟2)中的培養(yǎng)基表面進(jìn)行沖洗，使得紅曲霉孢子脫離培養(yǎng)基，制得紅曲霉孢子菌懸液，備用；B、原子能輻射誘變，將具體步驟A制得的紅曲霉孢子菌懸液置于⁶⁰Co-Y射線下方40CM處進(jìn)行輻射誘變，采用15萬拉德誘變劑量的⁶⁰Co，并且持續(xù)輻射誘變30min，制得誘變紅曲霉孢子菌懸液，備用；

4)將步驟3)經(jīng)過輻射誘變后的紅曲霉孢子菌懸液均勻灑在攤涼的大米粉上，通過手工翻拌2-3遍，保證紅曲霉孢子菌懸液均勻分別在大米粉上，然后將接種均勻的大米粉堆在紗網(wǎng)下，并加鋪毛毯，備用；