[發(fā)明專利]一種檸檬酸對小鼠胰島素抵抗形成的影響的實驗方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711408636.X
• 申請日: 2017-12-22
• 公開（公告）號: CN108159435A
• 公開（公告）日: 2018-06-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 阿依姑麗·艾合麥提;戴小華;王娟
• 申請（專利權(quán)）人: 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: A61K49/00
• 分類號: A61K49/00;A61K31/194
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11385
• 代理人: 董芙蓉

1.一種檸檬酸對小鼠胰島素抵抗形成的影響的實驗方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1、動物分組及給藥

昆明種小鼠，60只，雌雄對半，體重20±2g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SCXK新2016-0003；適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，小鼠隨機分為6組，每組10只，即正常對照組，高脂血癥模型組，陽性對照組給予血脂康及檸檬酸CA高、中、低劑量組；正常對照組每日灌服相應(yīng)體積的質(zhì)量分數(shù)為0.5％CMC-Na溶液，其他組于每日上午均灌服劑量為20mL·Kg^-1·d^-1高脂乳劑；下午正常組和模型組自由飲水進食，陽性對照組灌服血脂康200mg·Kg^-1·d^-1，CA高、中、低劑量組分別給予100、50、10mg·Kg^-1·d^-1，連續(xù)給藥4周，給藥期間，自由進水，進食；

步驟2、口服糖耐量實驗

于實驗第28天，禁食12h，尾部采血測空腹血糖；給予Control組灌胃0.5％CMC-Na、HFE組灌胃高脂乳劑、血脂康組灌胃200mg g·kg^－1的血脂康及CA+HFE組灌胃高脂乳劑和不同劑量的檸檬酸，20min后各組小鼠灌胃2500mg·kg^－1的葡萄糖，測定0、15、30、60、120min的血糖值，并計算各組120min內(nèi)的血糖曲線下面積；

步驟3、動物的處死

于實驗第30天，禁食12h，眼眶采血，制備血清，用于測定血清生化指標，快速解剖，取肝臟、骨骼肌，用于基因測序；

步驟4、生化指標測定

用TC、TG、HDL-C和LDL-C測定試劑盒分別測定血清中TC、TG、HDL-C及LDL-C的含量；用小鼠ELISA試劑盒檢測血清中胰島素的含量，并計算胰島素敏感指數(shù)及胰島素抵抗指數(shù)

步驟5、RT-PCR

使用Trizol提取樣品總RNA，Oligo dT Primer或dNTP Mixture將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；根據(jù)基因序列設(shè)計特異性引物，引物的核苷酸序列如SEQ:ID:NO:1-SEQ:ID:NO:6所示，通過實時熒光定量PCR，采用SYBR GREEN染料法，以actin為內(nèi)參基因，做相對定量檢測，并用2^-△△Ct法對數(shù)據(jù)進行相對定量分析；

步驟6、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗結(jié)果以x^-±s表示，組間差異的比較用單因素方差分析，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檸檬酸對小鼠胰島素抵抗形成的影響的實驗方法，其特征在于，與control組相比HM組血清的TG、TC和LDL-C，含量顯著升高，P<0.01，HDL-C含量顯著降低，P<0.01，說明高血脂模型的建立是成功的；與HM組相比CA組和血脂康組，血清TG、TC、LDL-C均明顯降低，P＜0.05，HDL-C的含量顯著升高，P＜0.01，說明CA具有降低血脂的作用。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檸檬酸對小鼠胰島素抵抗形成的影響的實驗方法，其特征在于，與control組相比HM組空腹及灌糖2h后的血糖值明顯高于control組，P<0.01，說明在高血脂癥小鼠組織對糖的利用率降低和糖代謝存在異常；與HM組相比CA組和血脂康組空腹及灌糖2h后的血糖值，均顯著降低，P<0.01，并恢復(fù)到和control組相當?shù)乃剑f明CA有調(diào)節(jié)小鼠糖代謝使之恢復(fù)正常的作用。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檸檬酸對小鼠胰島素抵抗形成的影響的實驗方法，其特征在于，與control組相比HM組的血糖GAUC顯著增大，P<0.01，說明高血脂癥小鼠對糖的代謝作用降低；與HM組相比CA組和血脂康組的血糖GAUC有顯著減小，P<0.01，并且CA組的血糖GAUC與control組相比無明顯差異，說明CA能夠促進機體對糖的代謝作用，恢復(fù)到control組的水平。