[發(fā)明專利]一種單細胞全基因組擴增試劑盒

在審

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• 申請日: 2017-12-22
• 公開（公告）號: CN108165610A
• 公開（公告）日: 2018-06-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李靜;陳昌岳;李明明;趙慧茹;鄭冠濤;路遠;胡秋萍;張祥林
• 申請（專利權(quán)）人: 上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/6806;C12N15/10
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• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明提供一種更佳的適用于單細胞全基因組擴增的試劑盒，一方面旨在通過優(yōu)化引物和擴增步驟，可有效應(yīng)用于固定后的單細胞樣本；同時將一種可以特異性切除尿嘧啶核苷酸的酶處理應(yīng)用于單細胞樣品擴增中，可以顯著降低擴增的錯誤率。相對于現(xiàn)有技術(shù)，該試劑盒更高效、簡單、實用、精準、損失少、成本低、方法重復(fù)性好、錯誤率低、非常適合固定樣本的單細胞全基因組擴增試劑盒，拓展了樣本應(yīng)用范圍，同時降低了錯誤率，提高了檢測的精密度。

技術(shù)領(lǐng)域

本專利屬于生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種單細胞全基因組擴增試劑盒，尤其涉及一種特別適合固定樣本的單細胞全基因組擴增，本專利拓展了樣本應(yīng)用范圍，同時降低了錯誤率，提高了檢測的精密度，因此具有廣泛的應(yīng)用前景。

背景技術(shù)

高通量測序技術(shù)快速發(fā)展，目前使用的測序樣本大多數(shù)還是數(shù)百萬甚至更多細胞的樣本。由于細胞數(shù)眾多，對其進行研究得到的結(jié)果只是一群細胞中信號的平均值，或者只代表其中占優(yōu)勢數(shù)量的細胞信息，而單個細胞獨有的特性往往會被忽視。特別是在腫瘤研究中，基因突變或者拷貝數(shù)變異只存在于極少數(shù)細胞(如早期癌細胞)中，多細胞擴增和分析無法檢測到這些微小的變異，這就使得單細胞測序尤為重要。

隨著技術(shù)的發(fā)展，單細胞測序越來越受到研究者的青睞，單細胞測序技術(shù)正逐漸從實驗研究方法成為指導(dǎo)臨床的有利工具，為基礎(chǔ)研究向臨床轉(zhuǎn)化搭建了橋梁。目前單細胞擴增方法主要有簡并寡核苷酸引物PCR擴增(Degenerated Oligonucleotide PrimedPCR，DOP-PCR)、多重置換擴增(Multiple Displacement Amplification，MDA)，以及多次退火環(huán)狀循環(huán)擴增(Multipe Annealing and Looping-based Amplification Cycles，MALBAC)等。但是現(xiàn)有技術(shù)中，大多數(shù)擴增方法只適用于活細胞樣本，而對經(jīng)過甲醛固定的樣本擴增效率較差，極大限制了單細胞的應(yīng)用范圍，如何解決固定樣本適用已成為現(xiàn)有技術(shù)中尚待解決的難題之一。

為了解決這一問題，本專利提供的試劑盒在樣本裂解過程中通過調(diào)整試劑成分、加入解交聯(lián)步驟、聯(lián)合磁珠PCR等方式進行優(yōu)化，可適用于固定后單細胞樣本的擴增，從而使得擴增對象不僅僅只適用于活細胞樣本，可適用于固定樣本，擴大了使用范圍，具有更加廣泛的應(yīng)用前景。

同時堿基錯誤也是現(xiàn)有技術(shù)單細胞擴增過程中面臨的主要難題之一。大量研究指出，SNV的假陽性主要是胞嘧啶突變成胸腺嘧啶(C→T)，如果能夠減少C→T突變的量，就可以大幅度降低單細胞擴增過程中的堿基錯誤率，減少SNV的假陽性。現(xiàn)有技術(shù)在擴增過程中，為獲得高保真、高覆蓋度基因組信息難度較大，除了改進擴增方法和分析手段以外，樣品的裂解往往會被忽視。在裂解過程中，基因組DNA解螺旋成線狀DNA雙鏈，與此同時，部分胞嘧啶會脫氨基成為尿嘧啶。雖然這一過程在細胞內(nèi)也會偶爾發(fā)生，但在體外裂解時，突變的頻率則大大提高。這些突變的尿嘧啶如果不經(jīng)過修復(fù)，會在指數(shù)擴增中被放大，最終導(dǎo)致SNV假陽性。實際操作中，裂解方法、DNA聚合酶的保真性、擴增區(qū)域的GC含量等都會導(dǎo)致堿基錯誤，從而產(chǎn)生非真實的單核苷酸變異，即SNV假陽性問題。

因此為了解決單細胞擴增中出現(xiàn)的堿基錯誤率高、擴增偏倚量大、擴增質(zhì)量不好、假陽性率高等問題，本專利同時創(chuàng)造性地設(shè)計并加入酶處理步驟，意想不到的將一種可以特異性切除尿嘧啶核苷酸的酶應(yīng)用于單細胞樣品擴增方法中，可以顯著降低擴增的錯誤率，降低了了非真實的單核苷酸變異產(chǎn)生，同時利用平行樣本分析方案，解決可能存在的等位基因缺失問題。

簡而言之，本專利提供了一種更好的高效、簡單、實用、精準、損失少、成本低、方法重復(fù)性好、錯誤率低、非常適合固定樣本的應(yīng)用的單細胞全基因組擴增試劑盒，拓展了樣本應(yīng)用范圍，同時降低了錯誤率，提高了檢測的精密度。

發(fā)明內(nèi)容