[發明專利]用于鑒定桃花粉育性性狀的單核苷酸多態性標記位點、引物對、試劑盒及應用

有效

• 申請號: 201711405949.X
• 申請日: 2017-12-22
• 公開（公告）號: CN107858448B
• 公開（公告）日: 2021-01-01
• 發明（設計）人: 曹珂;王力榮;朱更瑞;方偉超;陳昌文;王新衛;孟歌
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院鄭州果樹研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 鄭州華隆知識產權代理事務所(普通合伙) 41144
• 代理人: 經智勇

本發明公開了用于鑒定桃花粉育性性狀的單核苷酸多態性標記位點、引物對、試劑盒及應用，所述的單核苷酸多態性標記位點是桃基因組第6染色體的第2,116,368位核苷酸，該核苷酸為C或T。本發明通過對大量桃種質樣品的測序比對，鑒定出4063377個SNPs，利用這些SNPs對129份種質的粉育性性狀進行全基因組關聯分析，鑒定出與桃粉育性有顯著關聯的SNP位于第6染色體的第2,116,368bp處。并設計了特定的PCR引物擴增對和單堿基延伸引物，將完成單堿基延伸反應的的產物進行處理和分析，根據不同產物的分子量大小獲得其基因分型結果。利用本發明的單核苷酸標記位點進行檢測具有簡單、快速、成本低的優點，能夠實現生產中大規模的應用。

技術領域

本發明涉及用于鑒定桃花粉育性性狀的單核苷酸多態性標記位點、引物對、試劑盒及應用，屬于生物技術領域。

背景技術

選擇是育種中最重要的環節之一，它是指在一個群體中選擇符合要求的基因型，來進行后續的培育。但在傳統育種中，由于很難獲知后代的基因型，因此選擇的依據通常是表現型而非基因型，這種選擇方法對質量性狀而言一般是有效的，但對數量性狀來說，因為其表現型與基因型之間缺乏明確的對應關系，因而效率不高。此外，對于以果實性狀為目標的果樹來說，這些性狀都有其特定的表現時期，通常需要度過3-5年甚至更長時間的童期，因而選擇的時間較晚。這對于那些植株高大、占地多、生長季長的作物，特別是果樹之類的園藝作物，顯然是非常不利的。

近20年來迅速發展起來的基于DNA的分子標記技術，即“分子標記輔助選擇”(marker-assisted selection，縮寫為MAS)給育種提供了嶄新的途徑。它通過分析與目的基因緊密連鎖的分子標記的基因型來進行育種，從而達到提高育種效率的目的。Yamamoto(2001)利用AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism，擴增片段長度多態性)、RAPD(random amplified polymorphic DNA，隨機擴增多態性DNA)、SSR(Simple SequenceRepeats，簡單重復序列)和RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性內切酶片段長度多態性)標記，將果皮顏色定位第6連鎖群，與之連鎖距離最近(3.7cM)的SSR標記為UDP96-015。由于進行分子標記輔助選擇有兩個重要的前提，首先是必須得到與目標性狀緊密連鎖的標記，即建立目標基因與分子標記的連鎖關系。其次是檢測的自動化，由于分子標記輔助選擇要求對育種群體進行大規模檢測，因而要求檢測的方法要簡單、快速、成本低、比較準確，以實現檢測過程(包括DNA的提取、分子標記的檢測、數據分析等)的自動化。但是，可以發現在過去很長一段時間內采用的分子標記，如RFLP(RestrictionFragment Length Polymorphism，限制性內切酶片段長度多態性)、RAPD(randomamplified polymorphic DNA，隨機擴增多態性DNA)、AFLP和SSR等通常需要酶切或PCR后用電泳檢測分型結果，很難實現這一點。

SNPs標記(single nucleotide polymorphisms，單核苷酸多態性)主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性。它在基因組上分布廣泛，數量眾多，因此很容易檢測到相對于RFLP、RAPD、AFLP、SSR標記更連鎖的標記，且在檢測時具有高通量、簡單、快速、高靈敏度的優點，是進行分子標記輔助育種中最具潛力的標記。Chaparro(1994)發現花粉育性性狀可能有兩個基因，研究者發現在花粉可育的種質White Glory的2個雜交群體中，后代分離比不符合3:1，即該種質可能含有與之前報道的桃花粉不育基因(Ps)等位的另外一個基因Ps2，后者與垂枝和白花性狀連鎖。Dirlewanger(1998)利用FerjalouJalousia×Fantasia的F₂群體，將Ps定位在桃第6染色體，最近的RFLP標記為FG40。Jun(2004)利用Yumyeong×Baekhyang的F₁群體，利用RAPD標記開發了花粉育性的分子標記。