[發明專利]綿羊B4GALNT2基因全長序列的擴增及其表達量的檢測

有效

• 申請號: 201711405165.7
• 申請日: 2017-12-22
• 公開（公告）號: CN108085324B
• 公開（公告）日: 2020-08-25
• 發明（設計）人: 儲明星;郭曉飛;王翔宇;狄冉;劉秋月;胡文萍;梁奔夢;李曉雨;賀小云
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N15/113;C12Q1/686;C12Q1/6851
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;王璐

1.綿羊B4GALNT2基因，其特征在于，其核苷酸序列或其反義核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

2.一種綿羊B4GALNT2基因的擴增方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)經體外培養3天的綿羊顆粒細胞通過RNA提取試劑盒提取其總RNA，并分別按照Takara公司的Prime Script RT reagent Perfect Real Time試劑盒和SMARTer RACE 5’/3’Kit User Manual試劑盒說明書合成普通cDNA模板、5’cDNA第一鏈模板和3’cDNA第一鏈模板；

(2)利用步驟(1)所獲得的普通cDNA為模板，以6對擴增引物，通過普通PCR方法擴增B4GALNT2基因的各保守區序列；

所述6對擴增引物如下：

上游引物F1：ACCACTCCTTCAGCCTAGTG；

下游引物R1：TCATCGTCCACCCAGAGAAC；

上游引物F2：CAGACTGAACTCCCTGCGGTGA；

下游引物R2：CACATCCAGTTCGGTCTTCTC；

上游引物F3：AAGATTGAGGTGCTGGTGGA；

下游引物R3：TGCCCTGATCAGTGATTGGT；

上游引物F4：CAGCCCTGGAGAAGACCTAC；

下游引物R4：CCCACGCTCTGATCCTCTAA；

上游引物F5：CTTGAGGAAGTGGCAGTCTG；

下游引物R5：GCCACTGCGCTTACAAAGTA；

上游引物F6：ATGGGATGCAAGAAGGTGGA；

下游引物R6：TTTTGACCTACCGTGGCTGT；

(3)利用步驟(1)所獲得的5’cDNA第一鏈為模板，以5’GSP1和5’GSP2為擴增引物，通過降落PCR方法擴增B4GALNT2基因的5’端序列；

5’GSP1：AGAGGCTCTTGATGTGTTTCTCAGGGAG；

5’GSP2：CCCAGGGCCAAGAATAAGACGGACATC；

(4)利用步驟(1)所獲得的3’cDNA第一鏈為模板，以3’GOP為擴增引物，通過降落PCR方法擴增B4GALNT2基因的3’端序列，再以所獲得的降落PCR產物為模板，以3’GIP為巢式引物，進行巢式PCR擴增；

3’GIP：TGGGATGCAAGAAGGTGGAGGGCAGAG；

3’GOP：GATTCTCCCACTGCTGCGCTGCCTTTT；

(5)上述步驟(2)、(3)和(4)中最終所獲得的PCR擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，均經切膠純化后連接到pMD18-T載體，轉化到DH5α感受態細胞中，挑選陽性質粒，再通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定獲得所需目的條帶，通過Sanger測序得到綿羊B4GALNT2各保守區序列、5’端序列和3’端序列片段信息；

(6)將步驟(5)中擴增得到B4GALNT2的各保守區序列、5’端序列和3’端序列片段通過DNAMAN軟件進行序列拼接，得到綿羊B4GALNT2基因mRNA全長序列。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(2)中的普通PCR擴增程序為：95℃、5min，33×[95℃、30s，退火溫度、30s，72℃、45s]，72℃、8min，4℃保存。

4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(3)中的降落PCR擴增程序為：95℃、5min，10×[95℃、30s，72-0.4℃、30s，72℃、3min]，25×[95℃、30s，68℃、30s，72℃、3min]，72℃、8min，4℃保存。

5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(4)中的降落PCR擴增程序為：95℃、5min，10×[95℃、30s，72-0.4℃、30s，72℃、3min]，25×[95℃、30s，68℃、30s，72℃、3min]，72℃、8min，4℃保存；步驟(4)中的巢式PCR擴增程序為：95℃、5min，25×[95℃、30s，68℃、30s，72℃、3min]，72℃、8min，4℃保存。